【摘 要】
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日本乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）,是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一种虫媒性的人兽共患中枢神经系统传染病。亚洲及西太平洋的部分国家和地区是日本乙型脑炎的流行区域。感染后的妊娠母猪出现流产、死胎或胎儿畸形等繁殖障碍,人感染后会出现不可逆转的神经损伤,因此乙型脑炎已成为重要的公共卫生问题。细胞是生命活动的基本单位,
【基金项目】
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国家重点研发计划（2016YFD0500405）； 广东省重点领域研发计划项目（2019B020218004）； 国家自然科学基金面上项目（31272563、31672586、31941014）； 广东省“珠江学者”特聘教授和“青年长江”特聘教授专项；
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日本乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE）,是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一种虫媒性的人兽共患中枢神经系统传染病。亚洲及西太平洋的部分国家和地区是日本乙型脑炎的流行区域。感染后的妊娠母猪出现流产、死胎或胎儿畸形等繁殖障碍,人感染后会出现不可逆转的神经损伤,因此乙型脑炎已成为重要的公共卫生问题。细胞是生命活动的基本单位,各种各样的化学反应在磷脂膜区隔化形成的各种细胞器内有条不紊地进行,这些脂膜结构以及细胞质膜构成了真核细胞的生物膜系统（Endomembrane System）。外被体蛋白复合物Ⅰ（coat protein complexⅠ,COPⅠ）主要负责将物质从高尔基体逆向运至内质网,而COPⅡ则相反。细胞自噬是真核细胞内所特有的溶酶体依赖性的代谢途径,维持内环境的稳定。现有研究对于乙脑病毒在宿主细胞内的复制过程及致病机理尚未完全阐明。因此,探究乙脑病毒基因组具体的膜复制位点及宿主细胞内膜系统在其生命周期中的作用机制对于揭开乙脑病毒神秘的科学面纱显得尤为重要。本研究以日本乙型脑炎病毒SA14作为模式毒株,首先通过gate way系统构建了稳定表达膜性细胞器标志蛋白EGFP-RAB6A（COPⅠ调节因子）、EGFP-ERGIC53（ERGIC）、EGFP-sec24d（COPⅡ囊泡）、m Cherry-Giantin-C1（高尔基体中间脊）、YFPRAB7A（晚期核内体）、YFP-GALT（反式高尔基体）和EGFP-LC3（自噬体）的Hela细胞系,然后结合calnexin（内质网）、LAMP1（溶酶体）、GM130（顺式高尔基体）、EEA1（早期核内体）以及双链RNA抗体JZ,利用激光共聚焦技术发现乙脑病毒基因组复制复合体与calnexin（内质网）、RAB6A、ERGIC53（ERGIC）和LAMP1（溶酶体）存在明显的共定位现象。通过RNAi技术抑制COPⅠ囊泡的形成会显著抑制乙脑病毒的复制以及增殖,而抑制COPⅡ囊泡后乙脑病毒复制及增殖变化不大,COPⅠ抑制剂BFA处理也会显著抑制乙脑病毒蛋白的表达;其次,由于乙脑病毒基因组复制复合体与LAMP1（溶酶体）存在明显的共定位现象,于是我们猜测乙脑病毒是否利用自噬溶酶体膜结构作为其复制位点或探索细胞自噬在乙脑病毒生命周期中的作用。我们首先用双荧光标签tf-LC3和WB验证乙脑病毒感染Hela细胞会引起自噬的发生,发现乙脑病毒感染后的细胞会发生自噬,然后构建了一系列自噬相关基因敲除的细胞系,乙脑病毒感染早期的RNA复制、病毒蛋白表达及病毒粒子的释放均受到了明显的抑制,表明乙脑病毒感染后的细胞自噬促进乙脑病毒早期的复制过程。本研究探索到乙脑病毒SA14利用宿主细胞内的COPⅠ囊泡作为病毒基因组复制位点,发现了经典的细胞自噬促进乙脑病毒早期的复制过程,为寻找日本乙型脑炎的防治药物靶点提供了新的理论依据。
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