【摘 要】
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新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染引起鸡和多种禽类一种急性、败血性和高度接触性的动物传染病,对家禽业造成了巨大经济损失。V蛋白是NDV复制过程中编码的一种重要的非结构蛋白,具有多种生物学功能。病毒蛋白的功能一方面与其结构紧密相关,另一方面与病毒蛋白在宿主的亚细胞定位也有密切关系。目前,国内外关于V蛋白亚细胞
【基金项目】
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国家重点研发计划（2016YFD0501603）； 国家重点研发计划（2018YFD0500100）； 国家自然科学基金（31872492）； 广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项（2019KJ119）； 2018年省级现代农业科技创新联盟建设项目（2018
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新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染引起鸡和多种禽类一种急性、败血性和高度接触性的动物传染病,对家禽业造成了巨大经济损失。V蛋白是NDV复制过程中编码的一种重要的非结构蛋白,具有多种生物学功能。病毒蛋白的功能一方面与其结构紧密相关,另一方面与病毒蛋白在宿主的亚细胞定位也有密切关系。目前,国内外关于V蛋白亚细胞定位的研究较少,其依托的结构基础和生物学意义有待进一步阐明。因此,本研究通过核质分离、Western Blot和激光共聚焦等试验,探究了V蛋白在时间与空间上的亚细胞分布,结合基因缺失和定点突变方法分析了其结构基础,并初步探索了V蛋白核定位对其功能发挥的影响。主要研究内容如下:1.V蛋白亚细胞定位的研究本研究为确定V蛋白的亚细胞定位,首先检测了NDV基因Ⅶ型毒株r GM感染DF-1细胞和CEF细胞的亚细胞分布,结果显示r GM感染DF-1细胞或CEF细胞6 h后仅在细胞质检测到少量的V蛋白,12 h后在细胞核明显可见。不同基因型NDV感染DF-1细胞后V蛋白的亚细胞分布显示,基因Ⅶ型强毒株E105和Ⅸ型强毒株F48E9感染DF-1细胞后V蛋白能够入核,中强毒株B5（基因Ⅵ型）和E115（基因Ⅻ型）以及弱毒株La Sota（基因Ⅱ型）感染DF-1细胞后V蛋白均分布于细胞质。此外,真核表达质粒N1F-V在DF-1细胞中的亚细胞分布表明V蛋白大部分定位到细胞质,少部分定位到细胞核。2.V蛋白入核结构域和重要氨基酸位点的鉴定确定V蛋白能入核后,本研究进一步对蛋白序列进行分析,预测了3个可能的核定位信号（Nuclear localization signal,NLS）。通过构建和表达缺失NLS的V蛋白突变体,鉴定出NLS-2（aa138-167）或NLS-3（aa171-200）是V蛋白功能性NLS。由于NLS中碱性氨基酸位点对蛋白入核发挥重要作用,本研究通过定点突变技术将NLS中碱性氨基酸突变为丙氨酸并检测了突变体的核质分布。结果显示,R142和R152位点能够影响V蛋白入核。3.V蛋白核定位对其功能影响干扰素和细胞凋亡对病毒的感染与致病具有重要影响。目前较多的研究集中在V蛋白拮抗Ⅰ型干扰素的机制以及调控细胞凋亡。但是,尚不清楚这些功能的发挥是否与V蛋白的核定位有关。于是本研究通过双荧光素酶报告基因和q-PCR探究了V蛋白的核定位对IFN-β转录表达的影响。结果显示,V蛋白缺失NLS-2或NLS-3后丧失抑制IFN-β转录活性;R142和R152氨基酸位点突变后,虽然仍能抑制IFN-β产生,但抑制效果与野生型V蛋白相比减弱。IRF7作为调控干扰素产生的重要上游分子,V蛋白的表达能够下调IRF7的蛋白水平。为了阐明V蛋白的核定位能否有助于其抑制IRF7的表达,本研究检测了共转染后V蛋白对IRF7的表达影响。结果显示,V蛋白缺失NLS-2或NLS-3后以及R142和R152位点突变后对抑制IRF7的表达没有影响。说明V蛋白的核定位对抑制IFN-β的产生可能独立于IRF7的表达抑制或降解途径。为探究V蛋白核定位对细胞凋亡的影响,通过流式细胞术检测了N1F-V、V-△NLS2、V-△NLS3以及V-R142152A诱导DF-1细胞的凋亡率。结果显示,V蛋白缺失NLS-2和NLS-3后诱导DF-1细胞凋亡率分别为3.86%和7.17%;R142和R152氨基酸位点突变后V蛋白诱导DF-1细胞凋亡率为6.03%,三者都显著高于N1F-V的2.32%凋亡率,说明V蛋白的核定位对抑制DF-1细胞凋亡具有正向调控作用。综上所述,本研究首次证实NDV V蛋白能够入核,鉴定了其入核的功能域（aa138-167和aa171-200）与重要氨基酸位点（R142和R152）,并初步探索出V蛋白核定位参与拮抗IFN-β的产生和抑制细胞凋亡。本研究解析了V蛋白核定位与功能的联系,为理解病毒抵抗先天性免疫提供新的视角。
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