【摘 要】
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目的:细胞膜内外层磷脂分布的不对称性是由磷脂翻转酶维持的,当磷脂翻转酶功能缺失时,细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸会暴露至细胞表面,引发细胞凋亡。CDC50A是磷脂翻转酶的重要组成亚基,本研究通过敲除小鼠足细胞Cdc50a基因后发现足细胞变形受损,产生慢性肾病的早期症状,即蛋白尿的产生。基因敲除鼠随着月龄的增加足细胞损伤及丢失加剧、造成肾小球的滤过屏障功能严重受损,出现肾小球滤过率降低、肾小球系膜细胞增殖
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目的:细胞膜内外层磷脂分布的不对称性是由磷脂翻转酶维持的,当磷脂翻转酶功能缺失时,细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸会暴露至细胞表面,引发细胞凋亡。CDC50A是磷脂翻转酶的重要组成亚基,本研究通过敲除小鼠足细胞Cdc50a基因后发现足细胞变形受损,产生慢性肾病的早期症状,即蛋白尿的产生。基因敲除鼠随着月龄的增加足细胞损伤及丢失加剧、造成肾小球的滤过屏障功能严重受损,出现肾小球滤过率降低、肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质堆积、局灶性节段性肾小球硬化等一系列病理表型改变。本研究证实了细胞膜磷脂分布的不对称性对足细胞的存活和肾小球滤过屏障的完整性至关重要,并由此构建了一种全新的自发性肾小球硬化症小鼠模型。方法:1、杂交繁殖足细胞特异性Cdc50a基因敲除小鼠:研究使用的2.5P-Cre转基因小鼠为人NPHS2启动子驱动的足细胞特异性Cre重组酶表达小鼠,Cdc50a条件性敲除小鼠在Cdc50a基因3号外显子两侧插入了两个同方向的Lox P位点,当其与2.5P-Cre转基因小鼠交配后,在足细胞中表达的Cre重组酶对两个Lox P位点进行剪切和重组,导致Cdc50a基因3号外显子缺失,不能产生有功能的CDC50A蛋白,从而实现组织特异性敲除。通过将2.5P-Cre+和Cdc50alox P/lox P亲本小鼠进行杂交,获得2.5P-Cre+/Cdc50alox P/+、2.5P-Cre-/Cdc50alox P/+两种基因型小鼠,再将2.5P-Cre+/Cdc50alox P/+小鼠与Cdc50alox P/lox P小鼠杂交,获得基因型为2.5P-Cre+/Cdc50alox P/lox P（c KO）及2.5P-Cre-/Cdc50alox P/lox P（Control）的小鼠,二者交配后产生的后代用于实验。2、尿液生化检测:在c KO和Control小鼠1.5、2.5和3.5月龄时,取尿检测尿微量白蛋白、尿肌酐及尿电解质代谢情况。3、肾小球滤过率（GFR）检测:通过对小鼠尾静脉注射FITC-Sinistrin活体实时动态监测c KO和Control小鼠的GFR,评估肾小球损伤程度。4、HE、PAS染色观察c KO和Control小鼠肾脏结构、足细胞损伤程度及形态变化。5、TUNEL荧光染色观察c KO和Control肾小球足细胞凋亡情况。结果:1、通过将2.5P-Cre小鼠和Cdc50a条件性敲除小鼠进行三轮杂交,本研究成功获得了基因型为2.5P-Cre+/Cdc50alox P/lox P（c KO）及2.5P-Cre-/Cdc50alox P/lox P（Control）的大量同窝出生小鼠进行实验。2、尿液生化分析显示1.5月龄时c KO小鼠与Control小鼠的尿蛋白水平、尿电解质代谢及肾小球滤过率均无明显差异,肾重比也无统计学差异。在2.5和3.5月龄时,c KO小鼠与Control小鼠尿蛋白水平、肾重比及肾小球滤过率出现统计学差异（P＜0.05）,而尿电解质无明显差异。3、HE、PAS染色结果显示c KO小鼠与Control小鼠在1.5月龄时肾小球均无明显病变,从2.5月龄开始c KO小鼠肾小球出现基底膜增厚、基质沉积,肾小球纤维化及硬化甚至肾小球丢失的情况,与同月龄Control小鼠比较出现统计学差异。4、TUNEL荧光凋亡检测显示在1.5月龄时c KO小鼠与Control小鼠肾小球内均无明显凋亡信号,在2.5月龄时c KO小鼠与Control小鼠相比足细胞凋亡情况显著增加。1.结论:1.CDC50A在足细胞广泛表达,并维持足细胞质膜上的脂质不对称动态分布,足细胞特异性Cdc50a敲除后使得足细胞变形受损,产生慢性肾病的早期症状,即蛋白尿的产生,并且该过程发病较为迅速。2.足细胞特异性CDC50A缺失的进展过程中将使得足细胞损伤及丢失加剧、进一步影响足细胞存活及功能、出现肾小球滤过率降低、肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质堆积、肾小球硬化等一系列病理表型改变。3.通过足细胞Cdc50a基因敲除可以构建一种全新的自发性肾小球硬化症小鼠模型,该模型发病时间较短且表型较好。
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