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口蹄疫（Foot-and-mouse disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouse disease virus，FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病的暴发流行，给畜牧业生产和人民生活造成了极大的损失，国际兽医局将其列为A类动物传染病之首。病畜的临床症状包括沉郁、卧地、跛行、流涎，水疱常发生于口、鼻、蹄和母畜乳头等部位，水疱破损后导致溃疡或斑痂。感染FMDV的幼畜常发生不见临床症状的猝死。FMDV基因组为单股正链RNA，全长约8.5kb。FMDV基因组RNA只有一个约7kb的开放阅读框（open reading frame，ORF），编码一个大的多聚蛋白，在蛋白酶L、2A和3C的切割下形成一系列成熟的病毒蛋白。其中大部分切割是由3C及其前体蛋白完成的。3C蛋白除了可以切割自身多聚蛋白外，还切割宿主蛋白，抑制干扰素信号通路，负调控宿主细胞蛋白的转录和翻译，从而逃避宿主的天然免疫。SUMO（Small Ubiquitin-like Modifier）化修饰，是近些年来发现的一种与泛素化修饰具有相似酶促反应过程的蛋白翻译后修饰。SUMO化修饰具有多种生物学功能，例如维持基因组稳定性、调控转录因子活性、介导蛋白质之间的相互作用、调节蛋白质在细胞内的定位或稳定性、参与信号转导以及DNA损伤修复等。对微RNA病毒科而言，研究发现：肠病毒属的人肠病毒71型（EV71）的3C蛋白可以在Lys-52处发生SUMO化修饰，这种SUMO化修饰促进了3C蛋白的降解，降低了病毒的复制和致病力。由于FMDV和EV71属于同一个科--微RNA病毒科。设想：FMDV的3C蛋白是否也具有SUMO化修饰？FMDV3C蛋白的SUMO化修饰的生物学意义及其在病毒感染中的作用如何？为了研究这个问题，从以下几个方面展开了研究。 1、FMDV3C蛋白能够发生SUMO化修饰并以SUMO-1为主 通过GST Pull-down试验验证FMDV3C蛋白能够与Ubc9发生相互作用。间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay，IFA）结果显示FMDV3C蛋白与Ubc9、SUMO-1在细胞核内共定位。将表达FMDV3C蛋白的真核质粒pXJ-HA-3C与pXJ-Flag-SUMO-1、pXJ-Flag-SUMO-2或pXJ-Flag-SUMO-3共转染HEK-293T细胞，免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）检测证实3C蛋白均能与SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3发生SUMO化修饰，但以SUMO-1为主。体外SUMO化试验进一步证实FMDV3C蛋白能够发生SUMO化修饰。病毒水平FMDV3C蛋白的SUMO化修饰通过Co-IP及Western blotting也得到了验证。 2、51位、54位、110位、159位赖氨酸共同决定FMDV3C蛋白SUMO化修饰位点 首先利用生物信息学SUMO位点在线预测网站GPS-SUMO2.0Online Service推测FMDV3C蛋白潜在的SUMO化修饰位点，第51位赖氨酸最符合基序ΨKX（E/D），然而单赖氨酸突变体K51R及其相邻赖氨酸突变体K51R+K26R、K51R+K54R均能发生SUMO化修饰。利用定点突变技术将3C蛋白所含有的16个赖氨酸分别单个突变为精氨酸，遗憾的是，16个单突变体均能发生SUMO化修饰。通过SUMO化试验进一步缩小了3C蛋白发生SUMO化修饰的位点区域并结合软件分析，将软件预测得分最高的前几个赖氨酸两两突变、三三突变、多点突变及全部突变，通过Co-IP等方法确定51位、54位、110位、159位赖氨酸共同决定FMDV3C蛋白SUMO化修饰位点，并利用FMDV感染性克隆技术从病毒水平进行了验证。 3、SUMO化修饰对FMDV3C蛋白生物学功能的影响 通过比较野生型（WT）3C蛋白及其SUMO化修饰位点突变体3C K5154110159R两者功能的差异探究SUMO化修饰对3C蛋白生物学功能的影响。CHX chases和Western blotting试验结果显示，SUMO化修饰降低了FMDV3C蛋白的稳定性。FMDV3C蛋白切割3ABCmut试验结果显示，SUMO化修饰降低了3C蛋白的切割能力。Luciferase和Western blotting试验结果显示SUMO化修饰降低了FMDV3C蛋白对JAK-STAT信号通路的抑制作用。细胞凋亡试验结果显示，SUMO化修饰降低了FMDV3C蛋白引起的凋亡。 4、3C蛋白的SUMO化修饰在FMDV感染中的作用 建立检测FMDV Real-time PCR方法，合成针对SUMO化修饰过程中E2结合酶Ubc9和去SUMO化酶SENP1的SiRNA片段，转染BHK-21细胞后感染FMDV；将真核表达质粒pXJ-His-Ubc9和pXJ-Flag-SENP1分别转染BHK-21细胞后感染FMDV，综合Real-time PCR、TCID50、Westernblotting等结果，发现SUMO化修饰抑制FMDV的增殖。进一步利用FMDV感染性克隆技术从突变病毒水平进行了验证。 综上所述，发现了FMDV3C蛋白的一种翻译后修饰即SUMO化修饰，其位点由第51位、54位、110位、159位赖氨酸共同决定。该SUMO化修饰对3C蛋白的功能有一定的抑制作用，进一步研究发现，SUMO化修饰对FMDV的增殖具有一定的抑制作用，初步揭示了机体抵抗病毒的一种机制。