【摘 要】
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本文以罗非鱼骨为原料,选取常用的生物蛋白酶进行酶解,筛选出具有最高钙螯合能力的罗非鱼骨酶解物。通过反相高效液相色谱法对筛选酶解物进行分离纯化,获得具有高钙螯合能力的肽组分,对其肽段进行鉴定。利用鉴定肽段,制备肽钙螯合物,对其结构进行表征,预测肽段与钙的螯合机制。通过分子对接对制备肽段的成骨活性进行评估,筛选出具有潜在成骨活性的肽段。建立诱导RAW 264.7破骨细胞和MC3T3-E1分化成骨细胞的
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本文以罗非鱼骨为原料,选取常用的生物蛋白酶进行酶解,筛选出具有最高钙螯合能力的罗非鱼骨酶解物。通过反相高效液相色谱法对筛选酶解物进行分离纯化,获得具有高钙螯合能力的肽组分,对其肽段进行鉴定。利用鉴定肽段,制备肽钙螯合物,对其结构进行表征,预测肽段与钙的螯合机制。通过分子对接对制备肽段的成骨活性进行评估,筛选出具有潜在成骨活性的肽段。建立诱导RAW 264.7破骨细胞和MC3T3-E1分化成骨细胞的模型,对筛选肽段的成骨活性进行评价。主要研究结果如下:1.使用9种蛋白酶对罗非鱼骨进行酶解,以水解度和钙螯合能力作为筛选条件,得到最佳的水解蛋白酶为动物蛋白酶,其水解度为24.01%,钙螯合能力为50.18μg/mg。同时,对动物蛋白酶酶解物（TBEH）进行氨基酸组成分析,结果表明,氨基酸总量为838.70 mg/g,其中甘氨酸的含量最高,达到131.08mg/g;必需氨基酸含量为182.04 mg/g,占总氨基酸含量的21.70%;疏水性氨基酸总量为324.22 mg/g,占总量的38.66%。2.通过制备型与半制备型反相高效液相色谱法对TBEH进行两步分离纯化,得到具有高钙螯合能力的组分。利用高分辨质谱（UPLC-Q-Orbitrap-MS~2）鉴定分离组分中具有高钙螯合能力的多肽,分别为DGPSGPK（656.71 Da）、APEEHTP（779.35 Da）和QSGPAGPR（768.40 Da）,其螯合能力为111.98μg/mg、57.91μg/mg和114.31μg/mg。3.通过紫外光谱扫描（UV-VIS）、红外光谱扫描（FTIR）、X射线衍射分析（XRD）、电镜扫描（SEM）以及UPLC-Q-Orbitrap-MS~2对DGPSGPK、APEEHTP和QSGPAGPR与其钙螯合物的结构进行表征。UV-VIS,SEM与XRD结果显示,肽与钙螯合形成了新的化合物。FTIR与UPLC-Q-Orbitrap-MS~2的结果表明,多肽与钙的螯合位点主要存在于氨基N原子与羧基O原子。4.利用DGPSGPK、APEEHTP和QSGPAGPR与整合素1L5G和3VI4进行分子对接,三条肽与整合素之间形成了氢键和疏水作用,DGPSGPK显示较好的对接能力。建立RAW 264.7诱导分化破骨细胞以及MC3T3-E1细胞诱导成为成骨细胞模型,评估DGPSGPK的成骨活性。通过测定TRAP酶的酶活以及对TRAP酶进行染色可以看出DGPSGPK对于破骨细胞的分化具有显著的抑制作用,并成剂量依赖性增长,且具有统计学意义。建立以MC3T3-E1细胞,10 m M的甘油磷酸钠与50μg/ml的抗坏血酸进行诱导分化为成骨细胞的模型,使用不同剂量的DGPSGPK对成骨细胞的分化进行干预。以MTT实验测定DGPSGPK对MC3T3-E1细胞的促增殖作用,结果发现不同剂量的DGPSGPK对MC3T3-E1细胞均有促增殖效果,且当剂量为800μg/ml时,促增殖效果最好,在24h和48h的促增殖效果分别达到了142%和166%。随后测定了不同剂量的DGPSGPK对MC3T3-E1细胞分化为成骨细胞过程中的ALP酶酶活,并在第7天进行了染色。通过ALP活性测定和染色发现了DGPSGPK对MC3T3-E1细胞分化有着促进的作用。随后DGPSGPK对MC3T3-E1细胞分化为成骨细胞过程在21天时进行了茜素红染色实验,发现能够有效促进成骨细胞的矿化。
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