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目的:探讨尖吻蝮蛇毒抑瘤组分I(anti-tumor component-I from agkistrodon acutus venom,AAVC-I)诱导人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡中,蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/真核生物翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α)分子蛋白的检测,分析内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)PERK/eIF2α分子蛋白信号转导通路发生的机制。方法:本实验选择体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞作为研究对象,以对数生长期细胞进行实验,选择ERS诱导剂二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)作为阳性对照药物。1、运用MTT法检测不同浓度的DTT(1.0、2.0、4.0、8.0mM)和AAVC-I(2.0、4.0、8.0、16.0、24.0μg/ml)处理Tca8113细胞24h后的细胞增殖抑制率,并根据细胞增殖抑制率的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值筛选出阳性对照药物DTT的实验浓度,以及可能引起Tca8113细胞发生ERS最佳的AAVC-I实验浓度范围。2、根据筛选出的DTT和AAVC-I实验浓度组处理Tca8113细胞,24h后细胞苏木素伊红(haematoxylin&eosin,HE)染色倒置显微镜下观察细胞形态变化。3、采用Annexin V-FITC/PI双荧光染色法观察筛选出的DTT和AAVC-I实验浓度组处理Tca8113细胞24h后的凋亡情况,并进一步运用流式细胞术检测细胞凋亡率。4、筛选出的DTT和AAVC-I实验浓度组处理Tca8113细胞24h后出现凋亡时,蛋白质印迹(western blot,WB)检测ERS标志性分子蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78),PERK/eIF2α分子蛋白信号转导通路中的磷酸化PERK(phosphorylated-PERK)、磷酸化eIF2α(phosphorylated-eIF2α)分子蛋白以及下游的活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)、增强子结合蛋白同源蛋白(enhance-binding protein-homologous protein,CHOP)分子蛋白和细胞凋亡相关的B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、B细胞淋巴瘤-2相关蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)分子蛋白的表达水平。结果:1、不同浓度的DTT(1.0、2.0、4.0、8.0mM)和AAVC-I(2.0、4.0、8.0、16.0、24.0μg/ml)处理人舌鳞癌Tca8113细胞24h后,MTT法检测结果显示,随着DTT和AAVC-I浓度的增加细胞增殖抑制率逐渐升高(P<0.01),同时成功筛选出引起Tca8113细胞发生ERS的DTT阳性对照实验浓度组(4.0mM)和最佳的AAVC-I实验浓度范围(4.0、8.0、16.0μg/ml)。2、4.0mM DTT阳性对照实验浓度组和各4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml AAVC-I实验浓度组处理Tca8113细胞24h后,细胞HE染色倒置显微镜下观察发现,正常对照组细胞贴壁生长,细胞呈梭形或多边形,胞质密度分布均匀,AAVC-I实验浓度组细胞随着AAVC-I实验浓度的增加细胞逐渐皱缩变小,贴壁细胞逐渐减少,细胞间隙增大,胞质胞核浓缩,细胞破裂,特别是4.0mM DTT阳性对照实验浓度组和16.0μg/ml AAVC-I实验浓度组细胞形态变化最为明显。3、4.0mM DTT阳性对照实验浓度组和各4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml AAVC-I实验浓度组处理Tca8113细胞24h后,Annexin V-FITC/PI双荧光试剂对细胞进行荧光染色观察凋亡细胞以及流式细胞仪分析细胞凋亡率结果发现,与正常对照组相互比较,DTT阳性对照实验浓度组和各AAVC-I实验浓度组细胞在荧光显微镜下观察到被荧光标记的凋亡细胞,AAVC-I实验浓度组细胞随着AAVC-I实验浓度的增加,凋亡细胞逐渐增多,细胞凋亡率逐渐升高(P<0.01)。4、WB法检测了4.0mM DTT阳性对照实验浓度组和各4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml AAVC-I实验浓度组处理Tca8113细胞24h后的ERS标志性分子蛋白GRP78,PERK/eIF2α分子蛋白信号转导通路中的p-PERK、p-eIF2α分子蛋白,下游的ATF4和CHOP分子蛋白以及细胞凋亡相关分子蛋白Bax、Bcl-2的表达水平,结果显示,DTT阳性对照实验浓度组和各AAVC-I实验浓度组分子蛋白表达水平与正常对照组相互比较差异具有统计学差异(P<0.05),且随着AAVC-I实验浓度的增加GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP和Bax分子蛋白表达水平逐渐升高,而Bcl-2分子蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)。结论:1、DTT和AAVC-I具有抑制人舌鳞癌Tca8113细胞增殖的作用,成功筛选出浓度为4.0mM的DTT和4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml的AAVC-I作为引起人舌鳞癌Tca8113细胞发生ERS的最佳实验浓度组。2、以4.0mM的DTT浓度为实验阳性对照组,各4.0μg/ml、8.0μg/ml、16.0μg/ml AAVC-I实验浓度组可引起人舌鳞癌Tca8113细胞发生ERS。3、AAVC-I可诱导人舌鳞癌Tca8113细胞发生凋亡。4、ERS PERK/eIF2α分子蛋白信号转导通路在AAVC-I诱导人舌鳞癌Tca8113细胞发生凋亡时起着促进作用。