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[目的]肿瘤演进过程中,癌细胞与基质细胞代谢交互作用备受关注。癌相关成纤维细胞是肿瘤基质中主要组分,肿瘤对其高度依赖并与糖代谢密切相关,但机制未明。课题组前期研究发现舌鳞癌细胞高分泌血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）,并通过下调miRNA-26a-5p诱导成纤维细胞活化,但PDGF-BB是否可促进成纤维细胞糖代谢重编程产生乳酸反哺癌细胞及相关机制不清。本研究以PDGF-BB和乳酸为切入点,探索PDGF-BB和乳酸介导舌鳞癌细胞与癌相关成纤维细胞糖代谢偶联共生作用及分子机制,为探索通过干预PDGF-BB和/或乳酸作用逆转肿瘤发生发展奠定基础。[方法]1.常规培养人舌鳞癌细胞Cal-27、口腔黏膜正常成纤维细胞hOMF;酶消化组织块法和差速贴壁分离纯化舌鳞癌成纤维细胞和癌旁成纤维细胞。2.miRNA-26a-5p靶基因预测,双荧光素酶基因报告验证。构建过表达miRNA-26a-5p慢病毒载体转染成纤维细胞,以空载质粒为对照。q-PCR检测miRNA-26a-5p与靶基因表达情况。3.采用含20ng/ml PDGF-BB无血清培养基培养正常成纤维细胞3天,应用q-PCR、蛋白免疫印记、免疫荧光检测成纤维细胞活化、糖代谢和线粒体自噬相关指标。葡萄糖摄取实验和乳酸分析试剂盒分别检测葡萄糖摄取和乳酸分泌能力。JC-1和MDC分析线粒体膜电位和自噬情况;免疫荧光和透射电镜观察细胞内自噬体,Mitophagy试剂盒检测线粒体自噬。应用原代培养成纤维细胞和过表达miRNA-26a-5p成纤维细胞行进一步验证。4.建立PDGF-BB活化成纤维细胞与舌鳞癌Cal-27细胞间接共培养模型,CCK8检测Cal-27细胞增殖情况;q-PCR和ELSIA检测PDGF-BB表达和分泌情况;蛋白免疫印记检测bax、bcl-2、MCT-1、LDH-B和NF-κB/p-NF-κB,以及免疫荧光染色进一步分析MCT-1、LDH-B和NF-κB表达情况。5.构建裸鼠皮下移植瘤模型,测量瘤体体积和重量;免疫组化染色分析瘤体中α-SMA、MCT-1、MCT-4、LDH-A和p-NF-κB蛋白表达情况;多重免疫荧光染色分析α-SMA与MCT-4、LDH-A以及与LC3A/B共定位情况。6.数据以“均数±标准差（Mean±SD）”表示。独立样本t检验和方差分析分别用于两组间和多组间比较分析,p＜0.05有统计学意义,p＜0.01有显著统计学差异。用Graphpad Prism 5.0对数据进行分析和绘图。[结果]1.PDGF-BB干预成纤维细胞3天后,活化标志蛋白α-SMA、FAP-α和糖酵解相关蛋白GLUT-1、LDH-A、MCT-4表达增加,并且葡萄糖摄取和乳酸分泌能力增强,差异具有统计学意义（p＜0.05）。2.透射电镜结果显示PDGF-BB促进成纤维细胞内自噬体的形成;激光共聚焦显示细胞内LC3A/B表达增强。Mitophagy染色显示PDGF-BB促进成纤维细胞线粒体自噬的发生。蛋白免疫印记表明PDGF-BB促进线粒体自噬相关蛋白AMPK、LC3A/B、PINK1、Parkin 和 ULK1/p-ULK1 的表达,降低 P62 的表达,相比对照组,具有统计学意义（p＜0.05）。3.生物信息学分析表明miRNA-26a-5p与ULK1-3’ UTR存在结合位点。双荧光素酶报告验证了二者的结合。与空载组相比,miRNA-26a-5p下调线粒体自噬相关蛋白 AMPK、LC3A/B、PINK1、Parkin、ULK1/p-ULK1 的表达,上调P62的表达,差异具有统计学意义（p＜0.05）,免疫荧光和Mitophagy染色也显示miRNA-26a-5p下调LC3A/B表达和线粒体自噬。4.成功分离获得舌鳞癌成纤维细胞（CAFs）和癌旁成纤维细胞（NFs）。免疫荧光染色鉴定显示NFs和CAFs vimentin染色均呈强阳性,pan-cytokeratin染色呈阴性,可排除上皮性来源。CAFs α-SMA、FAP-α染色呈强阳性,而NFs呈弱阳性或者阴性。蛋白免疫印迹结果表明:PDGF-BB显著增强CAFs细胞线粒体自噬相关蛋白AMPK、PINK1、Parkin、ULK1的表达,并且增加LC3蛋白Ⅰ型向Ⅱ型的转变,下调P62的表达。免疫荧光和Mitophagy染色结果同样显示PDGF-BB增强了 LC3A/B蛋白的表达,并促进了线粒体自噬的发生。5.自噬抑制剂3-MA和线粒体自噬抑制剂mdivi-1可以降低PDGF-BB促成纤维细胞对葡萄糖的摄取和乳酸的分泌。蛋白免疫印记结果表明二者不仅可以下调糖酵解相关蛋白GLUT-1、LDH-A、MCT-4的表达,还可以抑制成纤维细胞活化标志蛋白α-SMA和FAP-α的表达;而线粒体自噬促进剂CCCP则可协同PDGF-BB对上述蛋白表达起到促进作用。同时,过表达miRNA-26a-5p后,同样抑制PDGF-BB促成纤维细胞活化和糖酵解水平。6.PDGF-BB活化成纤维细胞上清可促进Cal-27细胞增殖,加入单羧酸转运蛋白（转运乳酸）抑制剂CHC后,降低了其促增殖作用。乳酸也可促进Cal-27细胞的增殖,并下调bax表达,上调bcl-2、NF-κB、p-NF-κB、MCT-1和LDH-B蛋白表达;上调Cal-27细胞对PDGF-BB的表达和分泌,加入CHC和NF-κB通路抑制剂SC75741后,上述作用被明显下调,差异具有统计学意义（p＜0.05）。7.PDGF-BB活化成纤维细胞与Cal-27细胞共移植裸鼠皮下,与Cal-27细胞组相比,Cal-27+hOMF和Cal-27+CAFs组形成的混合移植瘤体积和重量明显增加,并且Cal-27+CAFs组更加显著,各组之间差异具有统计学意义（p＜0.05）。瘤体免疫组化染色显示α-SMA、MCT-4、LDH-A主要表达于肿瘤间质,p-NF-KB则主要表达于肿瘤细胞,MCT-1则在间质细胞和肿瘤细胞均表达明显。多重免疫荧光染色显示肿瘤间质中α-SMA与MCT-4和LDH-A以及与LC3A/B均存在明显共定位,并且LC3A/B荧光强度在Cal-27+hOMF和Cal-27+CAFs组明显增强,具有统计学意义（p＜0.05）。[结论]PDGF-BB通过下调miRNA-26a-5p表达,促进自噬/线粒体自噬,从而诱导成纤维细胞活化,并促进成纤维细胞糖代谢从以氧化磷酸化为主向以糖酵解为主的模式转变,产生乳酸;乳酸作为高能代谢产物,反哺于肿瘤细胞,促进肿瘤细胞增殖,抑制凋亡,并增强PDGF-BB的表达和分泌。肿瘤细胞与癌相关成纤维细胞通过PDGF-BB和乳酸形成正向反馈调节环,介导了二者之间的代谢共生。