【摘 要】
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目的:基于生物信息学分析TGF-β1、SMAD2、CyclinD1三个基因在临床胃腺癌患者中的治疗及预后意义;通过慢病毒载体技术构建过表达microRNA-155慢病毒表达载体,体外细胞实验构建稳定过表达microRNA-155-AGS细胞系,探讨过表达microRNA-155干预TGF-β/SMADs信号通路防治胃癌的效用机制。方法:1.从独立GEO数据集筛选胃腺癌差异表达基因;从TCGA中提取
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（项目批准号:81360531）； 广西一流学科建设重点项目（项批准号:2018XK081）；
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目的:基于生物信息学分析TGF-β1、SMAD2、CyclinD1三个基因在临床胃腺癌患者中的治疗及预后意义;通过慢病毒载体技术构建过表达microRNA-155慢病毒表达载体,体外细胞实验构建稳定过表达microRNA-155-AGS细胞系,探讨过表达microRNA-155干预TGF-β/SMADs信号通路防治胃癌的效用机制。方法:1.从独立GEO数据集筛选胃腺癌差异表达基因;从TCGA中提取胃腺癌患者的临床数据及TGF-β1、SMAD2、CyclinD1三个基因各自对应的表达量;进行基因本体功能分析及KEGG通路分析;采用Pearson相关系数评价胃腺癌中TGF-β1、SMAD2、CyclinD1表达水平之间的相关性;经Cox回归调整的单因素、多因素生存分析及Logistics回归调整的临床病理特征分析用于构建预后标志;通过联合效应生存分析评估预后标志的临床价值;利用miRNACancer MAP数据库构建泛癌microRNA-155通路网络。2.扩增含microRNA-155基因序列的基因片段,将扩增的目的基因片段克隆至LV5载体特定位点上;再将克隆成功的LV5-microRNA-155载体成分与三个包装质粒（p Gag/Pol、prev、p VSV-G）同时转染293T目的包装细胞,用以组装过表达microRNA-155重组慢病毒表达载体;从六种胃癌细胞株中筛选目的转染细胞,并进行细胞鉴定。3.对目的转染细胞（AGS细胞）进行分组干预:未作任何处理的AGS细胞为空白对照组（control组）;转染空序列慢病毒载体的AGS细胞为阴性对照组（OE-NC组）;转染过表达microRNA-155重组慢病毒载体的AGS细胞为实验组（OEmicroRNA-155组）。利用实时定量PCR检测microRNA-155和TGF-β/SMADs通路相关指标mRNA的表达;CCK-8法用于检测各组AGS细胞活力的变化情况;流式细胞仪用于检测各组AGS细胞周期及细胞凋亡的水平;Transwell法用于检测各组AGS细胞迁移及侵袭的能力;Western Blot用于检测TGF-β/SMADs通路相关指标蛋白的表达。结果:1.从独立GSE79973数据集中确定了TGF-β1、CyclinD1、SMAD2在正常胃黏膜组织和胃腺癌患者中存在差异表达;其中,SMAD2和CyclinD1在胃腺癌患者胃黏膜组织中呈高表达趋势。在443例胃腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线分析中显示,TGF-β1低表达和CyclinD1低表达的胃腺癌患者的总生存率优于TGF-β1高表达和CyclinD1高表达的胃腺癌患者;单因素、多因素Cox分析和Logistics回归分析结果显示胃腺癌患者TGF-β1高表达和CyclinD1高表达时,患者肿瘤的分级程度越高、临床分期越严重、区域淋巴结转移越快且涉及部位越多、总的生存率越差。miRNACancer MAP结果显示microRNA-155可能通过介导TGF-β信号通路、Hippo信号通路、Wnt信号通路参与STAD、COAD、LIHC、ESCA、LUAD等多种肿瘤的发生发展。2.通过扩增电泳和测序分析证实,过表达microRNA-155重组慢病毒表达载体被成功构建;并成功筛选出AGS细胞为目的转染细胞。3.与空白对照组和阴性对照组对比,OE-microRNA-155组中microRNA-155的表达水平明显增加,该实验组中AGS细胞活力明显下降,细胞周期被阻滞于G2/M期,细胞凋亡水平显著提高,AGS细胞的迁移和侵袭数目减少,TGF-β1、SMAD2、CyclinD1 mRNA和蛋白表达显著降低（P?0.05）。结论:1.生物信息学分析表明TGF-β1和CyclinD1可能作为胃腺癌预后的生物标志物,且microRNA-155可能通过介导TGF-β信号通路参与胃癌的发生发展;其研究结果为开展后续的体外胃癌细胞实验研究提供了一定的科学理论依据。2.成功构建了稳定过表达microRNA-155的AGS细胞系。3.初步证实过表达microRNA-155,可抑制TGF-β/SMADs信号通路介导的免疫失衡,同时也有效减弱了AGS细胞的迁移和恶性侵袭能力,促进了AGS细胞的凋亡,阻断了AGS细胞的快速增殖。
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