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研究目的急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）的早期形式,主要表现为进行性肺部炎症、肺泡毛细血管屏障通透性增强和肺水肿。尽管ALI/ARDS临床治疗策略已有显著进展,但仍无特异性治疗药物,患者院内死亡率仍高达40%。新型免疫检查点分子T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域（V-domain immunoglobulin suppressor of T cell activation,VISTA）,在肿瘤、自身免疫性疾病中的作用日渐凸显。既往研究发现,动物或细胞水平上敲除VISTA基因表现为抗肿瘤特性增强,并可促进炎症反应。鉴于VISTA在调控炎症反应中的重要作用,其在ALI中的作用值得深入探索,而既往未见明确文献报道。本研究旨在明确VISTA在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）致小鼠ALI中的作用,并对其潜在机制予以初步探讨。研究方法1.利用LPS构建两种小鼠ALI模型,探究VISTA基因敲除对小鼠ALI生存率、肺组织损伤严重程度和炎症因子水平的影响（1）气管内注射LPS致小鼠ALI（直接模型）:采用气管内单次注射LPS建立小鼠ALI模型。将已构建的VISTA KO小鼠和WT小鼠分别随机分为PBS对照组与LPS造模组,即WT Sham组、WT LPS组、KO Sham组和KO LPS组共四组。各组小鼠均为C57 BL/6背景,8-12周龄,雄性,20 g～25 g。采用气管内注射致死剂量LPS（20 mg/kg）构建ALI模型进行7 d生存率分析;采用气管内注射LPS（10 mg/kg）构建ALI模型,造模后6 h进行肺组织病理学分析、肺组织通透性及炎症因子水平检测等。所有对照组小鼠均予等体积PBS气管内注射。探究VISTA基因敲除对气管内注射LPS致小鼠ALI生存率、肺组织损伤严重程度和炎症因子水平的影响。（2）腹腔内注射LPS构建内毒素血症致小鼠ALI（间接模型）:采用腹腔内单次注射LPS建立内毒素血症致小鼠ALI模型,分组方法同上。采用腹腔内单次注射LPS（20 mg/kg）构建内毒素血症模型进行7 d生存率分析。采用腹腔内单次注射LPS（40 mg/kg）构建内毒素血症模型,造模后6 h进行肺组织病理学分析、肺组织通透性及炎症因子水平检测等。所有对照组小鼠均予腹腔内注射等体积PBS。探究VISTA基因敲除对腹腔内注射LPS构建内毒素血症致小鼠ALI生存率、肺组织损伤严重程度和炎症因子水平的影响。2.探究不同类型抗VISTA抗体对气管内注射LPS致小鼠ALI的影响（1）构建气管内注射LPS致小鼠ALI模型:选取8-12周龄雄性C57 BL/6小鼠（20g～25 g）予气管内单次注射LPS（10 mg/kg）建立ALI模型。将WT小鼠随机分为PBS对照组（Sham组）、LPS造模后同型对照抗体注射组（LPS+Ig G组）、LPS造模后13F3抗体注射组（LPS+13F3组）、LPS造模后MH5A抗体注射组（LPS+MH5A组）。PBS对照组气管单次注射等体积PBS,LPS组气管单次注射LPS（10 mg/kg）,LPS+Ig G组LPS注射后即刻尾静脉注射13F3抗体100μg/只,LPS+13F3组LPS注射后即刻尾静脉注射13F3抗体100μg/只,LPS+MH5A组LPS注射后尾静脉注射MH5A抗体20μg/只。（2）通过肺组织病理学分析、肺组织通透性及炎症因子水平检测等方法比较各组差异,探究VISTA阻断型抗体（13F3）和激动型抗体（MH5A）对气管内注射LPS致小鼠ALI模型肺组织损伤严重程度和炎症因子水平的影响。3.VISTA基因调控LPS致小鼠ALI机制的初步探讨（1）利用组织病理、免疫组化、免疫荧光等方法探究VISTA基因敲除对小鼠皮肤组织和肺组织的病理学特征及浸润细胞类型的影响。（2）构建腹腔内注射LPS构建内毒素血症致小鼠ALI模型,方法和分组同上。通过对各组小鼠肺组织进行转录组学分析和蛋白检测,探究VISTA基因敲除调控小鼠ALI的相关基因和通路。（3）利用WB法对LPS致ALI小鼠肺组织中的相关蛋白进行检测,以验证VISTA基因敲除调控小鼠ALI的相关机制。实验结果1.无论是气管内注射LPS致直接ALI还是内毒素血症致间接ALI,VISTA基因敲除显著降低两种ALI小鼠模型的7 d生存率,促进小鼠肺组织、肺泡灌洗液或血清IL-1β、IL-6和TNF-α的释放,显著增加小鼠肺组织W/D值和BALF总蛋白浓度并加重肺组织病理损伤严重程度。2.VISTA阻断型抗体13F3促进肺组织IL-1β、IL-6和TNF-α释放,增加小鼠肺组织W/D值并显著加重LPS致小鼠肺病理损伤严重程度;而VISTA激动型抗体MH5A可减少肺组织IL-1β、IL-6和TNF-α释放,降低小鼠肺组织W/D值并有效缓解LPS致小鼠肺病理损伤严重程度。3.VISTA基因敲除小鼠肺组织可见巨噬细胞募集。对腹腔内注射LPS构建内毒素血症致ALI小鼠肺组织的转录组测序结果显示,VISTA基因敲除可促进肺组织趋化因子CCL2、CXCL3,NF-κB信号通路因子NF-κB1和Rel以及炎症因子IL-1β和IL-6的表达。肺组织WB结果显示,VISTA基因敲除可显著增强LPS致小鼠ALI时肺组织中P65和P38磷酸化以及CCL2表达;VISTA阻断型抗体13F3可以促进P38磷酸化和CCL2表达;相反,VISTA激动型抗体MH5A可以抑制P38磷酸化和CCL2表达。实验结论VISTA基因的存在对LPS致小鼠ALI具有保护作用,VISTA基因敲除可加重LPS致小鼠ALI的严重程度,并降低小鼠7 d生存率。VISTA阻断型抗体可加重LPS致小鼠ALI的严重程度,而VISTA激动型抗体则可减轻LPS致小鼠ALI的严重程度。VISTA基因敲除可使NF-κB和MAPK信号通路激活,促进趋化因子CCL2和炎症因子的释放,从而加重LPS致小鼠ALI的严重程度。本研究初步表明VISTA基因对NF-κB和MAPK等炎症信号通路、CCL2等趋化因子和巨噬细胞募集具有抑制作用,这可能是VISTA调控LPS致小鼠ALI的重要机制之一。