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胎儿宫内生长受限（Fetal intrauterine growth restriction,Fetal IUGR）指胎儿受到各种有害因素影响而未能达到其遗传基因决定的全部生长潜能,出生后主要表现为低出生体重儿（Low birth weight infants,LBW infants）和小于胎龄儿（Small for gestational age infants,SGA infants）。IUGR是造成围产期胎儿死亡的重要危险因素;也是成年期代谢性疾病和精神分裂症高发的危险因素。过往研究病因更多关注营养因素;但越来越多的证据表明,有害环境因素是胎儿宫内生长受限的重要危险因素。砷（arsenic,As）是一类普遍存在于环境中的有毒类金属。全球约有1.4亿人饮用水受到砷污染。近年来,母体砷水平与胚胎发育的关系逐渐受到国内外专家的重视。流行病学调查和动物实验均发现母体砷暴露增加IUGR的发生风险。然而,孕期砷暴露引起IUGR的机制尚未阐明。本研究通过建立孕期砷暴露对胎盘和胎鼠宫内发育影响的动物模型;阐明胎盘滋养细胞侵袭在孕期砷暴露损害胎盘和胎鼠宫内发育中的作用;进一步探讨叶酸补充对孕期砷暴露损害胎盘和胎鼠宫内发育的拮抗效应。采用病例-对照研究方法,对比SGA和适于胎龄儿（Appropriate for gestational age infants,AGA infants）的母体尿砷水平,血清中富含半胱氨酸血管生成诱导因子61（Cysteine-rich angiogenic inducer,Cyr61）的含量和胎盘侵袭相关指标。该研究为评估孕期低水平砷暴露对育龄妇女生殖健康的损害作用并制定有效预防对策提供新线索,以及为筛选孕期砷暴露诱发胎儿生长受限的表观遗传生物效应标志提供实验资料。1.孕期砷暴露对胎盘和胎鼠宫内发育的影响本研究将CD-1孕鼠随机分成4组,从妊娠第0天至第18天暴露于含不同浓度NaAsO2的饮用水,即CTRL组、As-L组（0.15mg/L NaAsO2）、As-M组（1.5mg/L NaAsO2）和As-H组（15mg/L NaAsO2）。所有孕鼠于妊娠第18天剖杀,记录吸收胎数、死胎数、活胎数、活胎仔重量、活胎仔顶臀长、性别、胎盘重和胎盘直径。结果发现:相比CTRL组,As-L组、As-M组和As-H组平均每窝吸收胎数显著增加。此外,As-M组和As-H组的活胎仔平均体重和顶臀长均低于CTRL组。胎盘是维持母体与胎儿健康的重要器官。进一步分析发现,相比CTRL组,As-H组胎盘重量和直径显著降低。H＆E染色显示,As-M组和As-H组迷路层与滋养层长度的比值均低于CTRL组;同时,As-H组胎盘迷路层面积占胎盘总面积的百分比显著降低。通过PAS染色和苯酚浓硫酸法检测,发现相比CTRL组,As-M组和As-H组胎盘滋养层糖原阳性细胞数和胎盘糖原含量显著升高。以上结果提示,孕期砷暴露损害妊娠结局和胎盘发育,诱发胎鼠宫内生长受限。2.砷暴露对小鼠胎盘和人胎盘滋养细胞迁移侵袭行为的影响胎盘糖原细胞类似人类的侵袭性绒毛外滋养层细胞。经蛋白免疫印迹法检测,相比CTRL组,As-H组E-cadherin蛋白表达显著升高,然而Vimentin、N-cadherin、MMP2和MMP9蛋白表达显著降低。进一步利用体外实验检测NaAsO2处理对人胎盘滋养细胞迁移侵袭的影响。结果显示,经划痕、迁移和侵袭实验检测,As处理后细胞迁移和侵袭能力显著降低;此外,经蛋白免疫印迹法检测,As处理后细胞Occuldin蛋白表达显著升高,而Vimentin、N-cadherin、MMP2和MMP9蛋白表达降低。以上结果提示,砷暴露通过抑制小鼠胎盘和人胎盘滋养细胞迁移侵袭损害胎盘发育。3.Cyr61 m~6A修饰介导砷抑制胎盘滋养细胞迁移侵袭行为该部分目的是探讨砷暴露抑制小鼠胎盘和人胎盘滋养细胞迁移侵袭行为的机制。转录组结果分析显示,5个关键基因参与调节滋养层细胞发育,包括SPARC样蛋白1（SPARC-like protein 1,Sparcl1）,癌胚抗原相关细胞粘附分子（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule,Ceacam）13,Ceacam3,转化生长因子β2（transforming growth factor,TGFβ2）和富含半胱氨酸血管生成诱导因子61（cysteine-rich angiogenic inducer 61,Cyr61）。经RT-qPCR验证后,Cyr61mRNA在RT-qPCR和RNA-seq中变化倍数最显著。进一步分析,相比CTRL组,As-H组蛋白水平显著降低;同时,免疫组化显示,CYR61在胎盘迷路层和滋养层均表达;但As-H组CYRr61阳性细胞数显著低于CTRL组。此外,体外实验显示,As处理后Cyr61 mRNA和蛋白水平显著降低;免疫荧光结果表明,As处理后降低人胎盘滋养细胞CYR61阳性细胞数。mRNA稳定性异常影响其mRNA水平和蛋白表达。结果显示,As处理后人胎盘滋养细胞Cyr61 mRNA稳定性显著降低。m~6A修饰影响mRNA稳定性。意外的是,As处理后总体m~6A甲基化水平上升;然而,CYR61修饰位点的m~6A水平显著降低,且抑制了“m~6A阅读蛋白”胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins 2,IGF2BP2）与Cyr61 mRNA结合。以上结果表明,砷下调人胎盘滋养细胞CYR61 m~6A修饰并减少Cyr61 mRNA与IGF2BP2蛋白结合,降低Cyr61 mRNA稳定性,引起Cyr61 mRNA和蛋白水平下降,导致胎盘滋养细胞迁移侵袭受阻。4.S-腺苷蛋氨酸不足在砷下调胎盘滋养细胞CYR61 m~6A修饰中的作用该部分目的是探讨砷下调CYR61 m~6A修饰的机制。结果显示,As处理后m~6A甲基化转移酶Mettl3、Mettl14、Wtap、Rbm15和Rbm15b mRNA水平无显著改变;去甲基化酶Alkbh5 mRNA水平显著降低,而Fto mRNA水平无显著改变。但是,As处理后m~6A甲基化转移酶活性显著降低。S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）不仅是m~6A修饰的甲基供体,也是甲基转移酶发挥催化活性的必需辅助因子。As处理后细胞内SAM含量显著减少。以上结果表明,细胞内SAM耗竭引起甲基供体不足和甲基转移酶活性降低,可能是砷抑制滋养细胞CYR61 m~6A修饰的原因之一。砷（+3）甲基转移酶（Arsenic（+3）methyltransferase,As3MT）以SAM作为底物催化i As3+发生甲基化。体外实验证明,As3MT沉默后可逆转As下调SAM含量和m~6A甲基转移酶活性;同时,Cyr61 mRNA稳定性和蛋白表达水平恢复。进一步分析,发现As3MT沉默后恢复As所致Vimentin、N-cadherin和MMP2蛋白表达降低;经迁移和侵袭实验检测,As3MT沉默后可缓解As所致人胎盘滋养细胞迁移侵袭受抑。体外补充SAM实验,发现SAM补充后可恢复As所致细胞内SAM含量和甲基转移酶活性降低;同时,也可逆转As所致的Cyr61 mRNA稳定性和蛋白表达水平降低。进一步分析,发现SAM补充后恢复As所致的Vimentin、N-cadherin和MMP2蛋白表达水平降低;经迁移和侵袭实验检测,SAM补充后可缓解As所致人胎盘滋养细胞迁移侵袭受抑。5.体内叶酸补充对孕期砷暴露损害胎盘和胎鼠宫内发育的保护效应该部分研究将CD-1孕鼠随机分成4组,CTRL组、叶酸（Folic acid,FA）组、As组和As+FA组。相比As组,As+FA组胎鼠体重和顶臀长均显著增加。同时,相比As组,As+FA组胎盘直径和重量均显著上升;并且迷路层面积占胎盘总面积的百分比显著增加;以及迷路层与滋养层长度的比值也显著增加。进一步分析,发现As+FA组相比As组,细胞内SAM含量和m~6A甲基转移酶活性均显著上升;叶酸补充后可逆转孕期砷暴露所致CYR61和MMP2蛋白表达水平降低。以上结果表明,体内补充叶酸对孕期砷暴露损害胎盘和胎鼠宫内发育具有保护效应。6.人群验证母体尿砷含量、血浆CYR61含量和胎儿生长受限的相关性根据新生儿体重将胎儿分为AGA和SGA。以母体尿砷浓度为砷暴露标志,人群结果显示,SGA相比AGA母体尿砷含量显著增加;孕早期血浆中CYR61含量显著降低。此外,分析了母体尿砷与血浆CYR61含量之间的相关性,在AGA中,母体尿砷与血浆中CYR61含量呈负相关（R Sq Linear=0.08,P＜0.05）;在SGA中,母体尿砷与血浆中CYR61含量也呈负相关（R Sq Linear=0.26,P＜0.05）。同时,免疫组化显示,SGA组相比AGA组胎盘CYR61阳性细胞数显著减少。经蛋白免疫印迹法检测胎盘中Vimentin,MMP2和MMP9表达情况,SGA组相比AGA组Vimentin,MMP2和MMP9蛋白表达均降低;免疫组化显示,SGA组相比AGA组胎盘中Vimentin,MMP2和MMP9阳性细胞数均降低。本研究进一步从人群中验证了母体血浆中CYR61含量与砷诱发IUGR之间的呈负相关。根据以上所有结果得出,孕期砷暴露抑制滋养细胞迁移侵袭导致胎盘发育异常,诱发胎儿宫内生长受限。体内外实验证明,砷暴露导致CYR61 m~6A修饰不足降低Cyr61 mRNA稳定性和蛋白水平,是滋养细胞迁移侵袭受阻的原因之一。进一步分析发现,砷暴露耗竭细胞内SAM含量导致m~6A甲基供体和甲基转移酶活性降低,是CYR61 m~6A修饰不足的原因之一。体内补充叶酸后可逆转孕期砷暴露损害胎盘和胎鼠发育。通过病例-对照研究,发现母体血浆CYR61含量与砷诱发胎儿宫内生长受限之间呈负相关性。这些结果表明,SAM耗竭介导CYR61 m~6A下调所致滋养细胞侵袭受抑在孕期砷暴露诱发胎儿生长受限中的发挥重要作用。