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[研究背景]垂体腺瘤（Pituitary adenoma,PA）是最常见的颅内原发肿瘤之一,约占颅内肿瘤的16%,人群患病率达78-116/10万人。目前,PA的治疗,除了单纯泌乳素腺瘤可以通过药物治疗获得较好的疗效外,其它类型的肿瘤仍需通过手术切除治疗。虽然PA为良性肿瘤,但仍有高达35%的肿瘤会向周围结构（鞍膈、鞍上、海绵窦、蝶窦、斜坡）侵袭性生长,突入脑组织、脑室,包绕颈内动脉、颅神经,侵蚀骨质、硬膜,手术切除极其困难,术中、术后易并发各种严重并发症,肿瘤难以全切且复发率高,这类PA被称为侵袭性垂体腺瘤（Invasive pituitary adenoma,IPA）,是制约PA诊疗水平提高的关键因素。因此,迫切需要找到一种安全有效的治疗IPA的方法,故阐明IPA的发病机制,进而发现可能的分子标志物和治疗靶点,对全面提高PA的诊治水平至关重要。目前认为PA的发生、发展与基因突变、基因表达失调、表观遗传学改变等因素导致的细胞周期紊乱,细胞增殖失控有关。而随着基因测序分析技术的发展,越来越多的研究发现长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）在包括PA在内的很多肿瘤的发生、发展中起关键作用,但由于lncRNA数量庞大,我们对其的认识只是冰山一角,为了进一步探究lncRNA与PA特别是IPA进展的关系,我们对IPA和非侵袭性垂体腺瘤（Non-invasive pituitary adenoma,NIPA）组织进行了全转录组测序,筛选出差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA,确定目标lncRNA并对其进行进一步验证和研究。[目 的]通过对IPA和NIPA组织进行全转录组测序分析,筛选lncRNA、miRNA、mRNA差异表达谱,获得IPA中上调最显著的lncRNALINC00473,并构建其相关的竞争性内源 RNA（competing endogenous RNAs,ceRNA）调控网络（lncRNA/miRNA/mRNA）。进一步通过在离体PA组织、PA细胞系以及PA异体移植物模型中对基因测序结果进行验证,并探究LINC00473相关的ceRNA调控网络对PA增殖的影响及其分子机制。[方 法]1.对IPA和NIPA组织标本进行全转录组测序,通过对测序结果分析获得差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA,其中IPA中上调最显著的lncRNA为LINC00473,通过生物信息学分析结合既往研究结论,构建LINC00473相关的ceRNA调控网络。进一步通过qRT-PCR在IPA和NIPA组织标本中对LINC00473及目标miRNA、mRNA的表达水平进行验证,明确它们的表达水平与PA侵袭性的相关性。2.培养PA细胞株AtT-20、GT1-1用于PA细胞相关研究;构建过表达LINC00473、KMT5A 的载体和敲低 LINC00473、KMT5A 的靶向 siRNA,分别转染 PA 细胞;构建 miR-502-3p mimic和miR-502-3p inhibitor 转染 PA 细胞。通过qRT-PCR检测各组细胞过表达和敲低LINC00473、miR-502-3p和KMT5A的效率。3.通过CCK-8、EdU染色检测不同实验条件对PA细胞增殖能力的影响,流式细胞仪检测不同实验条件对PA细胞细胞周期的影响。Western blot检测不同实验条件对PA细胞中细胞周期素D1（cyclin D1）和细胞周期蛋白依赖性激酶2（Cyclin-Dependent Kinases 2,CDK2）及 KMT5A 表达的影响。4.分别研究下列几种实验条件对PA细胞增殖能力、细胞周期及cyclin D1、CDK2及KMT5A表达的影响:过表达和敲低LINC00473;过表达和抑制miR-502-3p以及过表达miR-502-3p同时过表达LINC00473;过表达和敲低KMT5A以及敲低KMT5A同时抑制miR-502-3p。5.双荧光素酶报告基因实验验证LINC00473和miR-502-3p之间,以及miR-502-3p和KMT5A之间存在功能性结合位点。6.PA异体移植物模型验证过表达和敲低LINC00473对肿瘤体积、增殖能力和miR-502-3p、KMT5A和cyclin D1和CDK2表达水平的影响。[结 果]1.通过对4例IPA和3例NIPA组织进行全转录组测序分析获得IPA与NIPA之间差异性表达的lncRNA、miRNA和mRNA,其中LINC00473是IPA中上调最显著的lncRNA,通过生物信息学分析结合既往研究结论,构建LINC00473相关的 ceRNA 调控网络 LINC00473/miR-502-3p/KMT5A,qRT-PCR 检测证实在离体IPA和NIPA组织中三者的表达水平与测序结果一致,三者之间表达水平相关性分析符合ceRNA调控机制。2.CCK-8、EdU细胞增殖实验结果证实过表达LINC00473和KMT5A及抑制miR-502-3p可以促PA细胞增殖,而敲低LINC00473和KMT5A及过表达miR-502-3p可以抑制PA细胞的增殖。过表达miR-502-3p产生的抑制作用可被过表达LINC00473中和,抑制miR-502-3p产生的促进作用可被直接敲低KMT5A抵消。3.流式细胞仪检测结果表明过表达LINC00473和KMT5A及抑制miR-502-3p可以使PA细胞周期中G0/G1期的细胞数量降低,G2/M期的细胞数量则增加;敲低LINC00473和KMT5A及过表达miR-502-3p可以使PA细胞周期中G0/G1期的细胞数量增加,G2/M期的细胞数量则降低。而过表达miR-502-3p产生的抑制作用可被过表达LINC00473中和,抑制miR-502-3p产生的促进作用可被直接敲低KMT5A抵消。4.Western blot证实过表达LINC00473和KMT5A及抑制miR-502-3p可以使KMT5A、cyclin D1和CDK2的表达上调;敲低LINC00473和KMT5A及过表达miR-502-3p可以使KMT5A、cyclin D1和CDK2的表达下调。而过表达miR-502-3p产生的抑制作用可被过表达LINC00473中和,抑制miR-502-3p产生的促进作用可被直接敲低KMT5A抵消。5.双荧光素酶报告基因实验证实LINC00473和miR-502-3P之间,以及miR-502-3p和KMT5A之间存在功能性结合位点。6.PA异体移植物模型显示过表达LINC00473可使肿瘤体积明显增大,肿瘤增殖能力增强,KMT5A及cyclin D1和CDK2的表达增加,miR-502-3p表达降低;而敲低LINC00473使肿瘤体积明显缩小,肿瘤增殖能力减弱,KMT5A及cyclin D1和CDK2的表达降低,miR-502-3p表达增加。[结 论]1.LINC00473和KMT5A在IPA中表达显著上调,而miR-502-3p呈显著下调;2.LINC00473/miR-502-3p/KMT5A 轴与 PA 的侵袭性密切相关;3.LINC00473可以促进PA的增殖,这种作用是通过抑制miR-502-3p从而促进KMT5A的表达实现的;4.LINC00473促进PA增殖的机制可能是通过抑制miR-502-3p从而促进KMT5A的表达,进而促进cyclin D1和CDK2的表达,加速细胞周期进程实现。