[目的]全球恶性肿瘤2020年统计数据显示,肝癌发病率位居第六位（新发905677例）,死亡率位居第三位（死亡830180例）。同年我国新发肝癌410038例,其中仅20%~30%患者能获取外科手术机会,且术后2年的复发率高达61.6%,其余初诊患者39.0%~53.6%已为肝癌晚期,总体死亡391152例,临床亟待更加有效的治疗方法抑制肝癌进展及术后复发。中晚期肝癌系统治疗取得较好临床获益,包括靶向药物联合免疫检查点抑制剂（ICI）以及局部治疗（TACE、RFA、HAIC、PVE等）联合靶向药物或联合ICI制剂等治疗,使巴塞罗那分期（BCLC）或中国肝癌分期（CNLC）较晚的部分原发性肝癌患者获得挽救性手术机会。但索拉菲尼在STORM实验的失败以及ICI药物导致的临床不良反应以及药品高昂的价格,限制了临床的广泛使用,需要探索更为丰富的治疗方法。新型免疫疗法疟原虫感染利用多种抑癌机制对肿瘤进行杀伤。疟原虫感染可对宿主免疫系统产生抗原性刺激并激活,不仅诱导宿主发热,活化NK细胞,提高Th1相关因子TNF-α、IFN-γ和IL-2血清浓度,还可抑制Treg、MDSC在肿瘤微环境的聚集,逆转TMAS细胞从M2向M1的转变,上调脾脏内CD8 α+DC浓度,激活肿瘤抗原特异性CD8+T细胞毒性杀伤能力,已在小鼠Lewis肺癌、三阴性乳腺癌、神经胶质瘤以及GPC3肝癌肿瘤疫苗的研究中均得到显著差异性阳性结果,但疟原虫感染在抑制肝癌进展及预防肝癌术后复发中的应用暂无数据可查。本研究参考以上现状,利用疟原虫感染肝癌荷瘤小鼠,揭示疟原虫感染对抑制肝癌进展及术后复发的作用机制,为临床对中晚期肝癌降期及预防肝癌切除术后复发提供更为丰富的研究思路。[方法]分别构建原发性肝癌小鼠模型和肝癌切除术后小鼠模型,验证疟原虫感染抑制原发性肝癌及预防肝癌切除术后复发的作用。模型一:构建原发性肝癌小鼠模型,旨在观察疟原虫感染对小鼠肝癌进展的抑制作用。小鼠称重,阿佛丁麻醉,开腹于肝脏左叶原位注射Hepa1-6肝癌细胞,关腹复苏后随机分组,实验组小鼠腹腔注射等量疟原虫,对照组为空白组。荧光成像定期监测两组小鼠腹腔内肝癌变化,记录两组小鼠体重、疟原虫感染率、生存期、肝癌重量、体积;部分小鼠于成瘤操作后第15天处死并收集肝脏及肝癌标本用以进一步分子实验;模型二:构建肝癌切除术后模型,旨在观察疟原虫感染对预防小鼠肝癌切除术后复发的抑制作用。采用移植瘤块成癌方法,第一步,构建肝癌皮下荷瘤小鼠:取2只小鼠分别右下肢腹侧皮下注射Hepa1-6肝癌细胞,观测成瘤后第14天脱颈椎处死小鼠并切除皮下肝癌瘤体,剔除附着结缔组织后将肝癌瘤体切分成1mm3瘤块置于冰水备用;第二步,构建肝癌移植成癌模型:模型小鼠称重,阿佛丁麻醉,开腹用硬膜外穿刺针吸附备用瘤块,在小鼠左外叶肝脏原位穿刺后留置瘤块移植成癌;第三步,构建肝癌切除术后模型:原位移植瘤成癌术后第21天,成癌小鼠再次接受手术,保证足够宽切缘（2mm）切除左外叶肝癌及附属肝叶;小鼠肝癌切除术后第3天随机分组,分别感染或非感染疟原虫,荧光成像定期监测两组小鼠肝癌术后复发,记录两组小鼠生存期;分子实验:提取实验组和对照组小鼠肝癌细胞RNA及蛋白分子;应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白印迹（western blot）以及免疫组化等试验方法,验证疟原虫感染对肝癌细胞上皮间质转化影响,测定EMT蛋白分子E-cadherin、N-cadherin 及 EMT 调控因子（EMT-TF）Twist、Vimentin、Slug、Snail等分子的差异,并对肝癌富表达趋化因子受体CCR10、CXCR2、CCR3,以及其下游信号通路PI3K/Akt/GSK-3 β/Snail进行检测,揭示疟原虫抑制肝癌细胞上皮间质转化预防肝癌切除术后复发的免疫机制。[结果]1.疟原虫感染规律与前期研究一致。疟疾自愈周期（原发性肝癌模型24天、肝癌切除术后模型27天）、感染率峰期（原发性肝癌模型18天、肝癌切除术后模型18天）及峰值（原发性肝癌模型60%、肝癌切除术后模型62%）结果稳定,所有小鼠均未发生严重群体性高疟原虫血症死亡。2.疟原虫感染对小鼠生活质量影响较小。原发性肝癌模型以及肝癌切除术后模型两个模型,疟原虫感染小鼠食饮、营养状况均未出现异常,体重保持总体增长趋势。3.疟原虫感染显著抑制肝癌活性。原发性肝癌模型:疟原虫感染组小鼠体内肝癌细胞光子数低于对照组（P＜0.001）;疟原虫感染组小鼠肝癌体积明显小于对照组（平均值:Hep:1.85cm3,Hep+Py:0.23cm3,P＜0.001）;疟原虫感染组小鼠肝癌重量显著低于对照组（P＜0.001）;疟原虫感染组小鼠癌性腹水率显著低于对照组（P＜0.001）。4.疟原虫感染显著抑制肝癌切除术后复发。肝癌切除术后模型,疟原虫感染组（20%,2/10）与对照组相比（80%,8/10）术后复发率显著下降。5.疟原虫感染显著延长肝癌小鼠生存期。原发性肝癌模型:对照组与疟原虫感染组中位生存期（mOS）对比（21天:未达,P=0.003）;肝癌切除术后模型,对照组与疟原虫感染组中位生存期（mOS）对比（39天:未达,P=0.002）。6.EMT标志性钙连蛋白,疟原虫感染组与对照组出现显著差异。对比疟原虫感染组与对照组肝癌组织,E-cadherin蛋白表达水平显著升高,mRNA表达水平显著升高,差异具有统计学意义（P=0.007）。7.EMT调节因子在疟原虫感染组与对照组小鼠肝癌之间出现差异性变化。Snail蛋白表达水平显著降低,mRNA表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.001）;Slug蛋白表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.001）;Twist蛋白表达水平显著升高,差异具有统计学意义（P=0.02）;Vimentin蛋白表达水平显著升高,差异具有统计学意义（P=0.004）。8.肝癌转移相关趋化因子受体CCR10/CXCR2/CCR3出现不同程度变化。对比疟原虫感染组与对照组肝癌组织:CCR10蛋白表达水平显著降低,mRNA表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P=0.001）;CXCR2蛋白表达水平及mRNA表达水平差异无统计学意义（P=0.27）;CCR3蛋白表达水平差异无统计学意义（P=0.75）。9.趋化因子胞内信号通路PI3K/Akt/GSK-3 β出现显著差异性变化。对比疟原虫感染组与对照组肝癌组织:PI3K/p-PI3K蛋白表达水平无明显差异;Akt蛋白表达水平差异无统计学意义,p-Akt蛋白表达水平显著降低（P=0.034）;GSK-3β蛋白表达水平未见显著差异,p-GSK-3 β蛋白表达水平出现显著降低（P=0.025）。[结论]疟原虫感染可抑制小鼠原发性肝癌肿瘤生长活性,显著延长荷瘤小鼠生存期。疟原虫感染能有效预防小鼠肝癌切除术后转移复发,延长荷瘤小鼠肝癌切除术后生存期。疟原虫感染通过抑制趋化因子受体CCR10,实现对肝癌细胞胞内信号通路PI3K/Akt/GSK-3β/Snail的磷酸化调控,抑制EMT调节因子的表达,解除E-cadherin的转录抑制,上调E-cadherin蛋白水平,逆转肝癌细胞的EMT,进而阻滞肝癌细胞的转移复发,并对宿主无明显健康损害,有望成为临床预防肝癌术后复发转移的新方法。