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研究背景原发性肝癌是亚洲人群最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高、预后差；乙型肝炎病毒感染会显著增加罹患肝癌的风险。HBV感染可能通过调控某些长链非编码RNA（LncRNA）影响肝癌的发生。但相关研究尚不深入，作用机制亦不明确。研究目的探讨在HBV感染中特定LncRNA对乙肝相关性肝癌发生及患者预后影响的分子机制，为寻找乙肝相关性肝癌的有效治疗方法提供实验基础。研究方法第一部分：原发性肝癌组织中的长链非编码RNA及mRNA的基因芯片筛选选取行根治性切除术的原发性肝癌患者10例，其中5例无HBV感染，5例合并HBV感染。术中取新鲜肝癌及对应癌旁组织，通过LncRNA芯片筛选出在乙肝相关性肝癌中特异性表达的一组LncRNA；通过mRNA芯片结合生物信息学分析筛选出在乙肝相关性肝癌中特异性表达同时影响力分析得分显著升高的一组mRNA；进而将两组基因进行表达水平趋势相关性分析，确定目标LncRNASNHG11和可能相关的mRNA。第二部分：基因芯片结果的验证与临床预后分析选取原发性肝癌患者60例，其中22例检测无HBV活动复制（HBV DNA≤1.0×103），38例存在HBV活动复制（HBV DNA>1.0×103），术中取新鲜肝癌及癌旁组织制作冻存样本，通过qRT-PCR实验检测不同组织中目标LncRNA和mRNA的表达水平，鉴定基因芯片结果的可靠性；选取原发性肝癌患者218例，其中109例无HBV活动复制，109例存在HBV活动复制，术中取新鲜肝癌及癌旁组织制作石蜡包埋样本，通过组织芯片和免疫组化染色技术检测评估待检mRNA编码蛋白的表达水平，结合患者临床数据和随访资料，对影响患者术后总体和无瘤生存率的因素进行分析，确定待检mRNA表达情况与乙肝性关性肝癌患者预后的关系。第三部分：LncRNA SNHG11在乙肝相关性肝癌中的作用机制研究HBV可能通过改变细胞微环境，影响特定LncRNA的表达，继而影响特定mRNA参与肿瘤进程。通过调控LncRNA SNHG11验证其对CLDN1表达的影响及对肿瘤细胞增殖、侵袭的影响，揭示乙肝相关性肝癌发生发展中LncRNA SNHG11的重要作用。研究结果第一部分：基因芯片和生物信息学分析结果显示：有22条LncRNA和2条表达通路（Leukocyte transendothelial migration通路，Cell adhesion molecules通路）上的共40条mRNA在乙肝相关性肝癌中呈现特异性转录，其中Claudin基因家族中有5条mRNA（CLDN1，CLDN2，CLDN10，CLDN14和CLDN19）影响因子分值显著高于其他mRNA。通过数据库资料查新和表达水平趋势相关性分析发现LncRNA SNHG11在各组织中的表达水平趋势与上述多条mRNA存在相关性，其中LncRNA SNHG11与CLDN1的表达呈显著负相关，由此确定LncRNA SNHG11为目标LncRNA。第二部分：qRT-PCR实验检测结果显示：在对照组（HBV DNA≤1.0×103）肝癌患者的肝癌及癌旁组织中，目标和待检mRNACLDN1的表达水平均无显著差异；在HBV活动复制组（HBV DNA>1.0×103）中，LncRNA SNHG11在肝癌组织的表达显著下降而在癌旁组织中升高；CLDN1在肝癌组织中表达显著升高而在癌旁组织中降低；与基因芯片检测结果基本一致，基因芯片可靠性较高。组织芯片免疫组化染色结果显示：CLDN1编码蛋白Claudin-1在HCC患者肝癌和癌旁组织中的表达差异普遍存在；Claudin-1在HBV活动复制组患者肝癌组织中的阳性率与肿瘤包膜的完整性存在关系；Claudin-1在对照组中肝癌和癌旁中的表达阳性与否并不显著影响患者的总体和无瘤生存期；而在HBV活动复制组患者肝癌组织中的阳性表达是影响患者术后总体和无瘤生存期的独立风险因素。进一步分析还发现：在HBV活动复制组，AST高水平和肿瘤细胞高分化等级是影响患者术后总体生存期的独立风险因素，AFP高水平、肿瘤包膜缺乏完整性及癌巢内出现血管癌栓是影响患者术后无瘤生存期的独立风险因素，而抗病毒治疗是影响术后总体和无瘤生存期的独立保护性因素。第三部分：以经稳定转染HBV基因的肝癌细胞株（HepG2.2.15细胞系）为实验载体，以过表达质粒的方式上调LncRNA SNHG11，qRT-PCR实验检测CLDN1的转录水平无显著变化，细胞增殖能力无显著变化，但侵袭迁移能力出现明显下降；以siRNA方式下调LncRNA SNHG11，qRT-PCR实验检测CLDN1的转录水平明显上升，同时细胞增殖能力出现显著增强，侵袭迁移能力亦明显增强。结论1、乙肝相关性肝癌呈现特异性的LncRNA转录谱；2、Claudin-1在肝癌组织中的阳性表达是影响在乙肝相关性肝癌患者术后无瘤生存期的独立风险因素；3、LncRNA SNHG11可以通过影响CLDN1的表达，进而影响肝癌细胞的增殖和侵袭迁移能力。本课题创新点及潜在应用价值本课题在基因芯片的基础上引入表达HBV全基因序列的肝癌细胞系统（HepG2.2.15细胞系），研究LncRNA SNHG11可能的作用方式，为揭示乙型肝炎病毒致肝癌发生发展中特定LncRNA分子的作用机制提供实验依据，为临床开发基于非编码RNA的肝癌分子治疗药物提供实验基础和潜在靶标。该研究结果对阐明乙肝相关性肝癌的发病机制以及寻找肝癌基因治疗新的药物靶点都具有重要意义。