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急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）是在较短的时间内突然发生的肾功能快速降低而引起的临床综合征。AKI发病率、死亡率高,且易发展为慢性肾病,缺血再灌注和肾毒性药物是临床上引起AKI的常见致病因素。AKI的病理生理机制相对复杂,目前临床上治疗AKI的患者主要以肾透析为主。因此积极探索AKI的发病机制,实现特异性的靶点治疗具有重要意义。iRhom2（inactive rhomboid protein 2,iRhom2,由Rhbdf2基因编码）蛋白作为Rhomboid家族中iRhoms亚家族的一员,属于一种不活跃的菱形丝氨酸蛋白酶。研究表明iRhom2通过参与调控胞内蛋白如肿瘤坏死因子-α-转化酶（Tumor necrosis factor-α-converting enzyme,TACE）、干扰素基因刺激蛋白（Stimulator of interferon genes,STING）等从内质网到高尔基体、核周微粒体的运输过程,在关节炎、病原体感染等炎症相关疾病中发挥重要作用。AKI发病机制复杂,越来越多的研究表明炎症在其中发挥重要作用,是否iRhom2参与调控急性肾损伤炎症反应目前尚未见报道。因此本课题主要研究iRhom2在急性肾损伤中的作用,并对机制进行初步探讨,以期找到参与AKI的关键分子,用于AKI的诊断与治疗。研究目的:1.通过体内动物实验、体外细胞实验及临床标本检测明确iRhom2在急性肾损伤中的表达模式。2.通过体内动物实验和体外细胞实验明确iRhom2在急性肾损伤中的作用。3.初步探讨iRhom2促进急性肾损伤的机制。研究方法与结果第一部分:iRhom2在急性肾损伤中的表达显著升高1.1 iRhom2在缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型中表达显著升高选用8周龄的雄性C57BL/6J小鼠,双侧肾动脉结扎30分钟,分别再灌注6h、12h、24h、48h构建肾脏缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury,IRI）模型。血清肌酐和尿素氮的结果显示AKI模型构建成功。二代转录组基因测序分析发现在肾脏IRI后iRhoms这一亚家族表达升高,且以Rhbdf2的升高尤为明显。同时实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-qPCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）及免疫组织化学染色（Immunohistochemical-staining,IHC）结果显示,iRhom2的表达呈时间依赖性升高,且在缺血再灌后12h表达相对较高。AQP1（近曲肾小管的标记物）、Calbindin D28K（远曲肾小管标记物）、AQP3（集合管标记物）,与iRhom2的免疫荧光（Immunofluoresce,IF）双标实验发现,肾脏IRI后,iRhom2主要在远曲肾小管中表达升高显著。1.2 iRhom2在体外模拟的多种缺氧模型中表达显著升高体外培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,应用糖氧剥夺（oxygen and glucose deprivation,OGD）、抗霉素 A 和 2-缺氧葡萄糖（anti-mycin A/2-hypoxic glucose,AA/2-DG）及氯化钴（CoC12）处理模拟缺氧模型,RT-qPCR及WB的结果显示,iRhom2在体外模拟的多种缺氧模型中表达显著升高。1.3 iRhom2在顺铂诱导的急性肾损伤模型中表达显著升高腹腔注射顺铂（25mg/kg）后,1天、2天、3天取材,血清肌酐和尿素氮的结果表明模型构建成功,RT-qPCR、WB及IHC的结果显示,顺铂注射后不同时间点iRhom2的表达升高,且在2天时表达相对较高。1.4 iRhom2在急性肾小管坏死的临床切片中表达显著升高IHC结果显示,与癌旁组织切片相比,在人的急性肾小管坏死临床切片中发现,肾小管中iRhom2的表达显著升高。第二部分:iRhom2在急性肾损伤中的作用研究2.1全身敲除Rhbdf2小鼠的构建利用Cre-loxp系统构建Rhbdf2-/小鼠,将带有loxp位点的Rhbdf2纯合雌鼠与带有全身cre酶的dppa3-cre+/-雄鼠交配,最后得到Rhbdf2-/-小鼠。提取鼠尾DNA鉴定小鼠基因型,结果显示Rhbdf2全身敲除成功。RT-qPCR及WB检测iRhom2在肾皮质中的敲除效率可达78%。2.2肾小管上皮细胞特异性敲除Rhbdf2小鼠的构建利用Cre-loxp系统构建肾小管上皮细胞特异性敲除Rhbdf2小鼠cdh16-cre+/-/Rhbdf2fl/fl（文中结果中标记为KSP-cre/Rhbdf2fl/fl）,提取鼠尾DNA鉴定小鼠基因型,结果显示:KSP-cre/Rhbdf2fl/fl即为肾小管上皮细胞特异性敲除Rhbdf2小鼠,二代转录组基因测序结果分析显示Rhbdf2外显子4-9敲除成功,进一步用RT-qPCR及IF检测结果表明iRhom2在肾小管上皮细胞的表达显著降低,以上结果表明肾小管上皮细胞敲除Rhbdf2小鼠构建成功。2.3 Rhbdf2缺失明显改善缺血再灌注诱导的急性肾脏损伤将8周龄大的雄性Rhbdf2fl/fl、Rhbdf2-/-和KSP-cre/Rhbdf2fl/fl小鼠,双侧肾脏缺血30min再灌注24h,构建IRI模型,检测各组小鼠的肌酐尿素氮结果发现,全身敲除及肾小管特异性敲除Rhbdf2后,可以明显降低缺血再灌注引起的血清肌酐和尿素氮升高,苏木素-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,HE）和过碘酸希夫染色（PeriodicAcid-Schiff staining,PAS）结果显示敲除Rhbdf2能明显改善缺血再灌注引起的肾小管肿胀、刷状缘及细胞核脱落。IHC的结果显示敲除Rhbdf2后能显著降低早期肾脏损伤标记分子:肾脏损伤标记分子-1（Kidneyinjurymolecule-1,Kim-1）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（Neutropil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）的表达。原位末端转移酶标记技术（TUNEL染色）结果进一步显示,肾脏缺血再灌注后显示TUNEL阳性的细胞明显增多,而敲除Rhbdf2后,肾脏凋亡细胞数明显减少。以上结果表明敲除Rhbdf2能显著改善缺血再灌引起的急性肾损伤,且肾脏IRI后全身敲除Rhbdf2组（Rhbdf2-/-）和肾小管特异性敲除Rhbdf2组（KSP-cre/Rhbdf2fl/fl）相比,肾脏损伤程度无显著差异,提示肾小管中表达的iRhom2在缺血再灌注损伤中发挥重要作用。2.4 Rhbdf2的缺失可明显改善顺铂诱导的急性肾损伤选用10周龄雄性的Rhbd2fl/fl和Rhbdf2-/-小鼠,注射顺铂（25mg/kg）构建急性肾损伤模型。血清肌酐、尿素氮检测结果,HE染色、PAS染色,以及NGAL的IHC结果显示,全身敲除Rhbdf2后,可以明显改善顺铂诱导的急性肾损伤。第三部分:iRhom2在缺血再灌注诱导的急性肾损伤中的机制研究3.1 iRhom2通过介导炎症反应加重缺血再灌注引起的急性肾损伤通过IHC标记巨噬细胞（CD68）,中性粒细胞（Ly6B）,结果显示Rhbdf2fl/fl小鼠在肾脏IRI后,巨噬及中性粒细胞的浸润明显增多,全身敲除及肾小管特异性敲除Rhbdf2,可显著减少巨噬及中性粒细胞的浸润。RT-qPCR检测TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-1β和IL-18等炎症因子的mRNA表达水平,结果显示与Rhbdf2fl/fl肾脏IRI模型组相比,敲除Rhbdf2后炎症因子的表达水平显著降低。体外应用NRK-52E细胞,进行OGD处理模拟肾脏缺血再灌注损伤模型。WB检测结果显示转染siRNA-Rhbdf2后iRhom2的表达抑制率可达58%。乳酸脱氢酶及Caspase-3活性检测结果显示,沉默Rhbdf2后可明显减轻OGD引起的NRK-52E死亡;同时RT-qPCR的结果显示,沉默Rhbdf2后TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-1β和IL-18等炎症因子的的mRNA表达水平显著降低,验证了体内的结果。以上结果提示Rhbdf2的缺失可以使得炎症细胞的浸润减少,炎症因子的表达减少,肾脏缺血再灌注损伤减轻。3.2 iRhom2可能通过参与内质网应激,调控ATF6剪切,加重肾脏缺血再灌注损伤内质网应激在急性肾损伤炎症反应中发挥重要作用,WB检测IRI模型中内质网应激信号分子的变化,发现iRhom2参与调控内质网应激信号通路,且以ATF6的信号通路变化最明显,提示iRhom2可能调控ATF6的剪切。体外实验CO-IP的结果发现iRhom2可能通过与ATF6结合调控其剪切过程。Rab9标记内质网,GM130标记高尔基体与iRhom2进行免疫荧光双标实验,发现NRK-52E细胞经OGD刺激后,iRhom2从内质网转位到高尔基体,以上结果提示iRhom2可能主要通过调控ATF6剪切参与内质网应激信号通路,加重肾脏缺血再灌注损伤,而iRhom2的转位是否可协助ATF6从内质网到高尔基体尚需进一步验证。结论与创新性:1.iRhom2在AKI的临床标本和动物模型中表达升高,通过增加炎症细胞浸润,促进炎症因子表达,加重AKI引起的肾脏损伤。同时发现肾小管上皮细胞特异性敲除Rhbdf2可以明显减轻炎症反应,改善急性肾损伤,与全身敲除Rhbdf2小鼠相比无显著差异,提示肾小管上皮细胞中的iRhom2在急性肾损伤中发挥重要作用。2.本研究拓宽了 iRhom2的生物学功能认识,发现iRhom2可能主要通过调控ATF6剪切参与内质网应激信号通路,加重肾脏缺血再灌注损伤,这为我们寻找特异性的作用靶点及治疗药物指明了研究方向。