在哺乳动物中,Sox9（SRY-related HMG box gene 9）基因直接受Y染色体上性别决定基因Sry激活,从而促使未分化性腺向睾丸发育,位于雄性发育分子级联通路的上游位置。与哺乳动物相比,爬行动物Sox9基因在性别分化中的具体功能及其在发育通路中所处的位置尚不明晰。中华鳖（Pelodiscus sinensis,P.sinensis）是我国名特优水产品之一,雄性个体具有生长快、个体大、裙边宽厚、单价高等优势,比雌性有着更高的养殖效益。由于中华鳖性别分化分子机制尚不清晰,阻碍了高（全）雄苗种培育技术的研发进程。本文以脊椎动物雄性分化保守基因Sox9为研究对象,对该基因在中华鳖早期不同胚胎发育阶段两性性腺中的表达分布进行检测,重点通过构建Sox9基因干扰和过表达胚胎模型,对该基因在中华鳖早期雄性分化中的生物学功能进行验证。研究内容和结果如下:（1）Sox9基因在中华鳖胚胎性腺中的时空表达分析通过转录组测序、实时荧光定量PCR和免疫荧光染色技术分别从m RNA和蛋白水平对Sox9基因在中华鳖不同发育阶段两性胚胎性腺中的表达分布情况进行检测。结果显示,Sox9 m RNA在第14期（stage 14/St.14,性别决定初期）胚胎性腺中已经出现表达,且在雄性（ZZ）性腺中的表达量显著高于雌性（ZW）性腺,至St.15时,在ZZ性腺中表达量达到最高,随后Sox9这种雄性高表达模式伴随着性别分化关键时期（St.15-St.21）。SOX9蛋白在St.15的ZZ性腺中已经大量表达,主要定位在在Sertoli前体细胞的细胞核中,并且随着性腺的分化发育,被检测到的SOX9蛋白荧光信号逐渐增强。至胚胎发育末期（St.27）,ZZ性腺中已形成明显的围绕生殖细胞的性索结构,此时SOX9蛋白主要分布在性索上的支持细胞的细胞核中,而在整个发育过程中的ZW性腺中几乎检测不到SOX9蛋白的表达信号。在性别决定和性别分化的关键时期（St.14-St.21）,Sox9始终维持雄性性腺特异性高表达,提示该基因在中华鳖早期雄性分化中具有重要作用。（2）Sox9敲低后中华鳖ZZ性腺的表达变化分析通过RNA干扰技术在中华鳖胚胎发育至St.14时,下调ZZ性腺中Sox9的表达量,构建了Sox9敲低的ZZ胚胎模型。待胚胎发育至St.27时,对敲低胚胎进行了性逆转分析。性腺组织形态学观察结果显示,Sox9敲低后的ZZ性腺出现了典型的雌性特征,向雌性逆转:性腺外形由短粗的圆柱状变成细长的扁平状,皮质区高度发育,形成多层细胞结构,髓质区退化严重,出现明显的腔隙结构。此外,生殖细胞呈现雌性性腺外层皮质区分布模式。分子水平检测结果显示在敲低Sox9后的ZZ性腺中,雄性特异性基因Dmrt1和Amh的表达量明显下降,而雌性特异性基因Foxl的表达量则显著上升。DMRT1蛋白表达几乎消失,FOXL2蛋白则被诱导大量表达。以上结果显示Sox9敲低后的ZZ性腺发生了雄性向雌性性逆转,逆转率87.88%（29/33）,表明在中华鳖早期雄性性别分化中,Sox9基因是必需的关键调控因子。（3）Sox9过表达后中华鳖ZW性腺的表达变化分析通过RNA过表达技术在中华鳖胚胎发育至St.15时,上调了ZW性腺中Sox9的表达量,构建了Sox9过表达的ZW胚胎模型。待胚胎发育至St.27时,通过性腺组织形态学观察及分子水平检测,对过表达胚胎进行了性逆转分析。结果显示,过表达Sox9后的ZW性腺向雄性分化,但性逆转不彻底,呈现雌雄间性状态:性腺出现少量类似雄性的性索结构,Dmrt1和Amh表达上升,Foxl2表达下降;在同一性腺中同时检测到了DMRT1和FOXL2蛋白表达的荧光信号。此外,本研究发现Sox9过表达后,在性别分化启动前的St.16的ZW性腺中雄性分化关键基因Dmrt1和Amh表达未发生明显变化,而课题组前期发现分别过表达Dmrt1和Amh后,均能够上调Sox9的表达量,并诱导ZW性腺向雄性彻底逆转。以上结果表明Sox9的异位表达能够诱导ZW性腺向雄性分化（逆转性腺呈现卵睾丸状态）,该基因受上游基因Dmrt1和Amh的调控。综上所述,Sox9在中华鳖早期雄性性别分化中是必需的关键基因,其缺失或过表达都会导致不同程度的性别逆转现象,在中华鳖雄性发育分子级联通路中位于Dmrt1和Amh的下游位置。本研究为阐明中华鳖性别决定和性别分化分子调控网络以及建立中华鳖单性育种技术奠定了理论基础。