[研究背景]慢性疼痛（chronic pain,CP）是持续到组织愈合后,没有预警等生物学价值的疼痛,具有患病率高、治疗难度大等特点。目前,慢性疼痛及其继发疾病导致的经济负担和药物滥用已成为世界性难题。神经病理性疼痛（neuropathic pain,NP）是慢性疼痛中最为常见且难以治疗的类型。慢性疼痛会引起相关“神经回路”的不同脑区发生不同程度的功能改变。研究认为这些功能改变所致的中枢敏化是慢性疼痛的促发及维持因素,但却很少有研究讨论发生这些改变所需要的时间及相关机制。低强度脉冲聚焦超声（low-intensity pulsed focused ultrasound,LIPUS）是一种重要的无创神经调控手段,能实现深达、多点、动态的精确调控,是低强度聚焦超声的主要形式。然而,LIPUS能否通过调控慢性NP相关脑区减轻疼痛还尚未见报道。本课题从GEO（gene expression omnibus）数据库中查找不同慢性NP小鼠模型的脑基因表达数据集,分析外周神经损伤时发生中枢敏化的可能机制及时间窗;以不同慢性状态NP时的脑基因改变为基础,研究NP不同时间点的聚焦超声中枢神经调控作用,探讨NP慢性进程中的中枢过程及机制,这有助于寻找聚焦超声干预的时机,为制定慢性疼痛的管理策略提供新的理论依据。[目 的]本研究旨在探讨NP时中枢神经系统基因表达与疼痛慢性化过程的相关性,分析疼痛慢性化过程内中枢敏化的可能机制和时间窗。基于脑基因分析结果,针对NP不同时期以聚焦超声调控前扣带回（anterior cingulate cortex,ACC）脑区,分析其疗效,并探讨LIPUS调控ACC缓解慢性NP的可能机制。[方法]本研究分为两个部分:第一部分:慢性神经病理性疼痛时中枢神经系统基因表达的分析研究1.不同时间点NP模型基因选择及分析:在GEO数据库中,以“pain”为关键词,寻找啮齿动物NP模型,研究造模手术成功后不同取材时间点的疼痛样本与非疼痛（假手术或未手术）样本的脑基因数据集,对这些数据集进行差异基因分析,通过String分析蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）交互节点,以R软件（V 3.6.3）的clusterProfiler包（V 3.14.3）富集各数据集的分子功能、生物过程和细胞组成,以matascape进行基因功能的富集分析。2.寻找与NP相关的中枢敏化时间及关键基因:不同数据集的差异基因富集分析结果比对中枢敏化相关研究。使用Cytoscape软件获得各差异基因集的关键（重要）基因,并对关键（重要）基因进行脑区表达分析,获得NP慢性化过程中脑基因与中枢敏化的关系及关键基因脑区分布。第二部分:聚焦超声对慢性神经病理性疼痛小鼠的ACC脑区调控作用的研究1.聚焦超声对慢性神经病理性疼痛小鼠ACC脑区的调控作用:选用坐骨神经慢性卡压性损伤（CCI模型）建立周围神经损伤神经病理性疼痛小鼠模型。根据慢性疼痛特点,选择与情绪相关的脑区（ACC）及抗抑郁相关参数。2.超声调控作用:体外实验:使用FUS2对ACC脑区脑片进行体外刺激,通过MEA方法记录刺激前、刺激时及刺激后的ACC脑区放电情况。短期实验:在CCI小鼠模型造模成功后将小鼠随机分为3组,FUS1组（PRF:1.5 kHz,SD:400 ms,DC:10%,FUS1:690 kPa,FF:3.7 MHz）,FUS2 组（PRF:1.5 kHz,SD:400 ms,DC:10%,FUS2:950 kPa,FF:3.7 MHz）及Sham组（假刺激）,于造模成功后第7天开始进行聚焦超声刺激,每天15分钟,共调控21天,3组的操作均为同步完成,每隔6天检测一次行为学以确定聚焦超声调控的效果。长期实验:CCI小鼠模型造模成功后将小鼠分为3组,FUS2组（PRF:1.5 kHz,SD:400 ms,DC:10%,FUS2:950 kPa,FF:3.7 MHz）、Sham 组（假刺激）和Control组（假手术）,于造模成功后第91天开始进行聚焦超声刺激,每天15分钟,共调控21天,每隔7天检测一次行为学以确定聚焦超声调控的效果。3.蛋白分析:长期实验中,对超声调控后的ACC脑区进行取材,提取蛋白,通过蛋白质谱和蛋白印迹测定及验证FUS2组、Sham组与Control组间的关键蛋白水平。4.安全性检测:通过计算ACC脑区受超声调控时的最大升温,结合HE染色结果,确认FUS调控ACC脑区时的安全性。[结果]第一部分:慢性神经病理性疼痛时中枢神经系统基因表达的分析研究1.在 GEO 数据库中筛选出 GSE111216、GSE9594、GSE71527 和GSE91396基因数据集符合目标要求,这些小鼠RNA数据集是不同NP造模手术成功后7天、9天、5周和2.5月取材检测的脑基因表达谱。2.各数据集均有明显差异表达基因。于 GSE111216,GSE9594,GSE71527和GSE91396四个数据集中各有11、63、218和210个差异表达基因,随着术后造模手术成功后取材时间点的不断延长,所获得的标本集内疼痛组与非疼痛组间的差异表达基因也逐渐增多,在GSE91396的差异基因中发现有92个基因为预测基因,对它们的功能研究仍不系统。3.通过String进行PPI交互节点分析,在GSE71527数据集中获得最多的交互节点（共 208 个）。以 R 软件（V 3.6.3）的 clusterProfiler 包（V 3.14.3）进行分子功能、生物过程和细胞成分的富集分析,在GSE71527数据集中出现最多的有效结果。最后以matascape进行基因功能的富集分析发现GSE71527数据集涉及到神经元的发育、激素运输及胆碱能突触传递等相关通路。4.与中枢敏化相关研究分别进行比较,提示在GSE71527数据集所涉及的功能及通路大多已涉及中枢敏化过程;最终,以Cytoscape软件分析四个基因数据集的关键基因（或重要基因）,并将各数据集的关键基因（或重要基因）带入HPA网络分析其脑组织的表达分布情况。发现随着造模手术成功后取材时间点不断延长,所出现的关键基因在脑中核团的分布情况呈泛化表现。以GSE71527数据集的关键基因进行富集分析,获得与慢性疼痛相关的通路。第二部分:聚焦超声对慢性神经病理性疼痛小鼠的ACC脑区调控作用的研究根据机械疼痛阈明显下降判定成功建立周围神经损伤性NP小鼠模型。实验发现“低占空比”的超声刺激可能抑制ACC产生有效的镇痛作用。最终超声刺激参数设定为:PRF:1.5 kHz,SD:400 ms,DC:10%,FUS1:690 kPa,FUS2:950 kPa,FF:3.7 MHz。1.体外实验:通过MEA方法记录FUS2（较强参数）刺激ACC脑区的神经元放电频率,提示聚焦超声刺激ACC脑区神经元时出现放电减少,且于刺激后仍有作用延续（FUS2 前:0.224±0.0023 Hz;FUS2 时:0.145±0.0218 Hz;FUS2 后:0.142±0.0176 Hz;p＜0.001）。2.短期实验:聚焦超声能改善小鼠对机械性疼痛的敏感程度（FUS1组:0.06±0.01 g,FUS2 组:0.32±0.09 g,Sham 组:0.04±0.01 g,p＜0.01）,但发生在超声干预全疗程（21天）完成以后。3.长期实验:在聚焦超声干预开始后,小鼠的机械性疼痛敏感程度就发生了改善（FUS2 组:0.17±0.04 g,Sham 组:0.06±0.02 g,p＜0.05）,且疗效持续到超声刺激之后,而热痛回缩阈值及坐骨神经指数的改善不显著。4.蛋白分析:通过蛋白质谱分析提示差异表达蛋白主要涉及细胞过程和信号传导、以及信息的存储和处理,富集结果显示这些差异表达蛋白与机体三个主要系统有关,包括内分泌系统、免疫系统和神经系统。对蛋白质谱进行分析后提示:对应的关键基因为:Hnrnphl,Hnrnpd,Snrpb,Dhx16。所对应的蛋白进行蛋白印迹方法的验证,发现FUS2组与Control组间HNRNPH1和HNRNPD呈同步变化。FUS刺激可下调HNRNPH1和HNRNPD水平,可能由此抑制了NP的发展,在NP中起关键作用。5.安全性检测:ACC脑区受超声调控时的最大升温仅有0.1℃,结合HE染色结果,确认FUS调控ACC脑区时颅内无组织损伤表现,同时,CCI手术局部发现异物肉芽肿形成。[结论]1.在慢性神经病理性疼痛的形成及发展过程中,随着造模手术成功后取材时间点的延长,所获得的疼痛样本与非疼痛样本间脑差异表达基因呈增加趋势。这些差异表达基因形成的交互位点也在不断增加。2.随着造模手术成功后取材时间点的延长,各数据集所富集的功能及通路也是不断增加的,在5周后取材的数据集GSE71527富集到了多条与中枢敏化相关的通路,提示损伤后需要一定时间（本研究考查时间为:5周）已能活化与中枢敏化相关的通路。相应的关键基因（重要基因）在脑中的表达分布也呈渐泛化表现。3.ACC脑区受聚焦超声调控时放电减少,这种调控作用是能延续的。4.本研究中所用参数的FUS刺激,对ACC局部无损伤作用,是安全有效的治疗疼痛的手段。5.聚焦超声对ACC脑区进行调控,短期实验及长期实验的机械性回缩阈值均有改善,但短期实验的作用发生较晚,长期实验时在调控开始即有改善,考虑与长期实验时发生中枢敏化相关,而短期实验中中枢敏化尚未发生,同样的干预后疗效发生较晚。6.蛋白质谱分析提示差异表达蛋白主要涉及细胞过程和信号转导以及信息的存储和处理,FUS刺激可以下调HNRNPH1和HNRNPD水平,从而抑制了NP的发生发展。