伴随着AIDS、恶性血液病及骨髓移植、实体器官移植、各种导管植入等的增多，侵袭性真菌感染（invasive fungal infection，IFI）的高危人群也日益增加，曲霉和念珠菌是最常见的致病真菌，其中又以血流感染和肺组织侵犯最常见。IFI因其临床表现多样，诊断困难，疗效不佳，预后差而备受关注。近年来，针对IFI的诊断和检测手段不断改进，新型抗真菌药物和剂型也相继研发并投入临床应用，在一定程度上提高了患者的疗效，但IFI的病死率仍高达50%～95%。感染继发的免疫损伤是导致患者死亡的重要原因。宿主天然免疫系统有效的识别入侵的病原真菌，触发恰当的免疫反应，是改善预后的关键，但宿主对真菌感染免疫机制目前并不明确，因此深入探究IFI的免疫机制，帮助易感者建立免疫预防，促使感染患者免疫重建，对预后改善有重要意义。天然免疫细胞，模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），激酶以及细胞因子等构成了复杂而有机的免疫网络，肺泡巨噬细胞（alveolar marcrophages,AMs）是天然免疫的前哨，位于AMs上的PRRs激活后，能进一步激活细胞内相应的信号网络，分泌细胞因子，趋化中性粒细胞到达感染部位，诱导局部炎症反应，进而诱导相应的适应性免疫。近期研究发现，C型凝集素受体家族（CLRs）在抗真菌免疫中发挥重要作用，成为真菌感染免疫领域研究的热点。Dectin-2是新近发现的CLRs，属于Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要在巨噬细胞、树突状细胞表达，通过识别真菌细胞表面的α-甘露聚糖启动抗真菌免疫。在念珠菌感染的相关研究中证实：Dectin-2激活后能诱导天然免疫细胞分泌IL-1β、IL-12p70、IL-23、TNF-a等多种细胞因子，并诱导T_h1和T_h17细胞活化，但优先诱导T_h17细胞活化，T_h17细胞通过分泌IL-17A、IL-17F，诱发特异性抗真菌免疫。虽然Dectin-2在白念珠菌感染相关的免疫研究中取得了一些进展，但其在曲霉感染免疫中的作用及其机制研究仍是空白，本研究首先确定AMs Dectin-2在烟曲霉感染肺组织中的表达特点，再通过建立AMs烟曲霉感染的体外模型，进一步观察Dectin-2在烟曲霉感染过程中的表达特点和功能，探究AMs Dectin-2在烟曲霉感染免疫调节中的作用。第一部分Dectin-2在烟曲霉感染肺组织中的表达特点目的：近期研究发现，Dectin-2在小鼠白念珠菌感染中发挥重要的抗真菌免疫作用，并且在人肺组织中发现了Dectin-2mRNA表达，但Dectin-2在人肺组织中的表达特点及其与烟曲霉感染的关系尚不清楚，本研究旨在明确Dectin-2在烟曲霉感染人肺组织中的表达特点。方法：搜集烟曲霉感染及其相应的正常人肺组织，提取组织总RNA，总蛋白，或制做组织石蜡切片。用CD206标记肺泡巨噬细胞，用Real-time qPCR，Western blot，免疫组化方法检测正常及烟曲霉感染肺组织中Dectin-2、CD206mRNA和蛋白质的表达特点。肿胀烟曲霉孢子体外刺激单核细胞源性巨噬细胞（monocyte derivedmacrophage，MDM）细胞1h，感染复数（multiplicity of infection，MOI）为1，Real-timeqPCR检测刺激前后Dectin-2、CD206mRNA表达的变化；流式细胞仪检测刺激前后Dectin-2、CD206蛋白表达的变化。结果：在正常肺组织中Dectin-2、CD206mRNA及蛋白表达均呈低水平，在烟曲霉感染的炎症组织中Dectin-2、CD206mRNA分别升高了5.34倍和5.16倍（p<0.001），Dectin-2与CD206mRNA的表达呈明显正相关（r=0.88，p<0.001）。Western blot分析显示，在烟曲霉感染炎症组织中Dectin-2和CD206蛋白分别升高了1.71倍和1.85倍（p<0.001）。Dectin-2与CD206蛋白的表达呈明显正相关（r=0.82，p<0.001）。免疫组化检测分析显示，炎症肺组织中Dectin-2和CD206的蛋白表达量均明显升高，Dectin-2主要表达在CD206阳性细胞上。Dectin-2和CD206蛋白的平均光密度值分别增加了1.83倍和2.21倍（p<0.001）。Dectin-2和CD206蛋白的表达呈明显正相关（r=0.97，p<0.001）。在体外研究中，肿胀烟曲霉孢子刺激1h后，MDM细胞表面Dectin-2和CD206mRNA分别升高了16.76倍和14.32倍（p<0.01）。Dectin-2和CD206蛋白的平均荧光强度值分别升高了4.56倍和4.43倍（p <0.05）。结论：Dectin-2主要特异性表达在人AMs，烟曲霉感染的炎症肺组织中，Dectin-2的表达量明显升高。烟曲霉孢子体外刺激MDM细胞后，Dectin-2和CD206mRNA及蛋白表达量明显升高。提示Dectin-2可能在肺部烟曲霉感染免疫中发挥重要作用。第二部分肺泡巨噬细胞Dectin-2在烟曲霉感染免疫中的作用机制目的：在白念珠菌感染的相关研究中发现，Dectin-2能诱导NF-κB激活，并在抗真菌免疫中发挥保护作用。但Dectin-2在烟曲霉感染中的免疫机制尚不明确，本研究旨在探讨AMs Dectin-2在烟曲霉感染中的作用机制。方法：建立烟曲霉感染THP-1巨噬细胞的体外模型，用Dectin-2siRNA沉默Dectin-2的表达，在烟曲霉孢子感染的不同时间点，用Real-time qPCR，Western blot或ELISA法分别检测Dectin-2干扰前后炎症介质IL-1β，IL-10，IL-23p19和TNF-α及信号蛋白Syk，p-Syk，IκB，P65，c-Rel表达特点；用Syk抑制剂抑制Syk蛋白的活化，比较Syk抑制前后炎症介质和信号蛋白的变化。用倍比稀释法检测Dectin-2沉默前后以及Syk抑制前后巨噬细胞对烟曲霉孢子杀灭百分率的变化，流式细胞仪检测Dectin-2沉默前后以及Syk抑制前后巨噬细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）释放的特点。结果：静息烟曲霉孢子刺激后，THP-1巨噬细胞上Dectin-2的表达随刺激时间明显升高（p<0.05），热灭活孢子刺激无相应的的变化（p>0.05）。显微镜下观察发现，烟曲霉孢子和THP-1巨噬细胞共孵育4h后开始肿胀；6h后孢子发芽；8-10h后有菌丝形成;热灭活孢子形态无变化。细胞因子IL-1β，IL-10，IL-23p19，TNF-α的mRNA和蛋白分别在6h和8h后明显升高，并随时间延长而升高（p<0.05）；热灭活孢子刺激无相应的变化趋势（p>0.05）。烟曲霉孢子刺激后，磷酸化的Syk，IκBα；细胞核中c-Rel，p65随时间明显升高。Dectin-2siRNA沉默后Syk和IκBα的磷酸化受到明显抑制；c-Rel，p65明显减少；相应细胞因子分泌明显受到抑制（p<0.01）。Syk蛋白阻断后Syk和IκBα的磷酸化明显抑制；细胞核内c-Rel，p65也有不同程度的抑制；c-Rel蛋白的相对表达量抑制了77%～93%（p<0.01）；p65蛋白的相对表达量抑制了10%～80%（p<0.01）；相应细胞因子的分泌抑制了70%～80%不等（p<0.01）。在MOI为1时，巨噬细胞对肿胀孢子和静息孢子的杀灭百分率分别为27.8%和6.24%；在MOI为0.1时对肿胀孢子和静息孢子的杀灭百分率分别为48.08%和16.64%，对肿胀孢子的吞噬杀灭百分率明显高于静息孢子（p<0.01）。在MOI为0.1时，巨噬细胞的杀灭能力更强（p<0.01）。肿胀孢子刺激后活性氧的荧光强度值增加了18.07倍（p<0.01），静息孢子和热灭活孢子刺激无相应的变化（p>0.05）。Dectin-2沉默以及Syk阻断后，ROS的荧光强度值分别抑制了62.2%和73.89%（p<0.01）。结论：在烟曲霉感染中，AMs Dectin-2-Syk信号通路介导了NF-κB的激活，并诱导Th1和T_h17细胞的分化，Dectin-2-Syk-信号通路介导了AMs对烟曲霉孢子的杀灭和巨噬细胞ROS的释放。