产细菌素乳酸菌的筛选及抑菌作用的研究

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乳酸菌抑菌肽是乳酸菌在代谢过程中产生的一类具有活性的蛋白质物质或多肽,可将食品中的腐败菌或病原菌杀死或抑制。很多乳酸菌产生的抑菌肽不仅可以抑制相关菌种,还能抑制很多种类的革兰氏阳性或阴性腐败菌和食源性致病菌。科学家们在抑菌肽被广泛应用之前就已经发现了某些细菌具有抑菌活性,甚至在抑菌肽生产菌没有确定的条件下,就已经将抑菌肽应用于发酵食品中。近几年,在乳酸菌对其他细菌的拮抗作用的机理中,乳酸菌抑菌肽是研究得最多的。乳酸菌抑菌肽在食品行业中具有广泛的应用前景,它被认为是一种“天然”的食品添加剂而容易被人们接受。本研究从13种样品中分离出37株乳酸菌,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为指示菌,通过打孔法从中筛选出了 9株具有不同抑菌能力的乳酸菌。在排除酸作用并经过蛋白酶酶解实验后,选择出所产细菌素抑菌效果最显著的菌株LY用于后续研究。通过PCR扩增LY菌株16s rDNA并测定其序列,经NCBI序列比对分析鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。采用硫酸铵沉淀法去除LY菌株发酵上清液中的大分子蛋白,经乙酸乙酯萃取、凝胶柱层析过滤和半制备高效液相色谱纯化,获得纯细菌素。液相色谱-串联质谱法测定该细菌素的分子质量为1069Da。该细菌素具有良好的热稳定性,在121℃下加热30min仍能保持良好的抑菌活性。4℃保藏3个月活性无明显损失。耐酸碱范围广,在pH2-9范围内显示抑菌活性。植物乳杆菌LY所产细菌素可被胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K降解,失去抑菌活性。该细菌素具有较宽的抑菌谱,既可抑制革兰氏阳性菌也可抑制革兰氏阴性菌的生长。经96孔板法测得该细菌素对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)为50mg/mL。菌体经细菌素处理后,菌悬液中紫外吸收、电导率、碱性磷酸酶和蛋白含量均有不同程度增加,细胞膜通透性遭到破坏。扫描电镜和透射电镜观察细菌素处理后的赖氨酸芽孢杆菌和溶酪巨型球菌,与未处理的指示菌相比,处理后的指示菌出现凹陷、破裂、渗漏、空洞等现象,导致目标菌死亡。
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