【摘 要】
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[目 的]本研究针对辅助生殖助孕技术中的胚胎反复种植失败,从男性角度出发,通过单细胞甲基化测序技术,比较第一次移植后即获得正常临床妊娠且活产的女性丈夫的精子和有胚胎反复种植失败病史的女性丈夫的精子之间的甲基化差异,探寻辅助生殖中男性精子DNA甲基化与女性胚胎反复种植失败之间的病因学联系,从而筛选出与胚胎反复种植失败相关的精子DNA差异甲基化位点、基因和通路,为后续的临床诊断及靶向治疗提供理论参考依
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[目 的]本研究针对辅助生殖助孕技术中的胚胎反复种植失败,从男性角度出发,通过单细胞甲基化测序技术,比较第一次移植后即获得正常临床妊娠且活产的女性丈夫的精子和有胚胎反复种植失败病史的女性丈夫的精子之间的甲基化差异,探寻辅助生殖中男性精子DNA甲基化与女性胚胎反复种植失败之间的病因学联系,从而筛选出与胚胎反复种植失败相关的精子DNA差异甲基化位点、基因和通路,为后续的临床诊断及靶向治疗提供理论参考依据。[方 法]本研究根据纳入及排除标准,选取20例前来昆明医科大学第一附属医院生殖遗传科行辅助生殖助孕的男性精液进行研究。其中,10例为有胚胎反复种植失败病史的女性丈夫的精液,设为实验组;同时期采用辅助生殖助孕技术,第一次移植后即获得正常临床妊娠且活产的10例女性丈夫的精液,设为对照组。从昆明医科大学第一附属医院生殖遗传科生殖中心管理系统中导出患者的一般资料,包括夫妻双方年龄、身高、体重、男性精液常规分析数据等。所有纳入研究的患者均自愿参加本研究、并签署知情同意书。采用精液DNA纯化试剂盒提取精子DNA,经测试DNA的浓度和纯度达到要求后行单细胞DNA甲基化测序,然后将所获得的数据进行生物信息学分析。[结 果]1、实验组与对照组男女双方的年龄及BMI之间无显著性差异（P＞0.05）,两组男性的精液量、精子浓度、精子活动率和精子活动力之间也没有显著性差异（P＞0.05）,但实验组女性的平均年龄高于对照组,同时实验组男性的精子参数也略有下降趋势。2、在不同覆盖深度下实验组CpGs覆盖深度显著大于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;实验组全基因组甲基化水平与对照组相比,差异无统计学意义（47.0%VS47.4%,P＞0.05）;对实验组和对照组进行组间甲基化相关性分析,发现两组组间相关性之间差异有统计学意义（P＜0.05）,实验组相关性略高于对照组（0.97%VS0.96%）;对不同功能区域甲基化水平进行分析,发现实验组的外显子区域、基因间区、启动子区域的甲基化水平高于对照组。3、在实验组和对照组之间共发现560个差异甲基化区域。与对照组相比,实验组高甲基化的差异甲基化区域数目为261个,低甲基化的差异甲基化区域数目为299个。对启动子区域和差异甲基化区域重叠基因进行分析,共有66个差异甲基化区域相关基因定位于启动子部分,与生殖相关的基因共有16个,其中ST3GAL3、LASP1、DOT1L、CEACAM1、PINCH、STAT5A参与胚胎发育及胚胎着床等过程;对差异基因进行GO富集分析,发现富集度最高的15个GO Term中与生殖相关的 GO Term 共 4 个:GO:0051481、GO:0008331 和 GO:0034704 参与胚胎和胎盘的生长发育的调节,GO:0052812影响胚胎着床。另外,本研究还筛选出备选通路25条,其中高甲基化基因数目为97个,低甲基化基因数目为63个,尽管这些通路图富集分析不显著,但是可以从功能注释角度解释其生物学意义。[结 论]通过生物信息学分析,与有胚胎反复种植失败病史的女性丈夫的精子相比,第一次移植后即获得正常临床妊娠且活产的女性丈夫的精子在外显子区域、基因间区、启动子区域具有较高的甲基化水平,两者之间存在许多差异甲基化区域。这些差异甲基化区域重叠基因可能参与调控胚胎发育及胚胎着床等过程,进而引起胚胎的反复种植失败。本研究筛选出560个差异甲基化区域、66个与胚胎反复种植失败相关的备选基因及15个富集度最高的GO Term,其中6个基因及4个GO Term已报道参与胚胎发育及胚胎着床等过程。另外,本研究还通过通路图显著性富集确定DMR相关基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径,共筛选出备选通路25条,可以从功能注释角度解释其生物学意义。以上结果均说明精子DNA甲基化可能与辅助生殖中胚胎反复种植失败相关,为下一步深入探寻胚胎反复种植失败的致病机制研究提供新思路,也为后续的临床诊断及靶向治疗提供新的理论基础。
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