论文部分内容阅读
果生刺盘孢是苹果炭疽叶枯病的主要病原菌,它不仅可以侵染叶片造成早期落叶,还可以危害苹果果实,引起果实斑点,给苹果的品质和产量造成严重的影响。果生刺盘孢引起的苹果炭疽叶枯病近年来在我国苹果产区快速蔓延,对于果生刺盘孢的致病机理目前还了解很少。有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)是MAPK信号通路的关键因子,是参与细胞信号转导,调控细胞生长、分化、环境适应的重要因子。丝状真菌中,MAPK基因Pmk1所在的Fus3/Kss1-MAPK通路是调控病原菌交配、生长、产孢、和致病的关键基因。本研究以果生刺盘孢1104-B菌株为研究对象,通过基因敲除技术获得Pmk1缺失突变体,再通过对该突变体的表型变化研究推断该基因的功能,以期阐明果生刺盘孢的致病中的作用。主要研究结果如下:1.基于基因重组技术,PEG介导原生质体转化技术,共获得抗潮霉素的转化子52株,通过PCR检测、玻璃纸穿透试验筛选、共得到基因敲除突变体两株,分别是1104Pmk1-37B和1104Pmk1-38B。2.将突变体以及野生型菌株分别在PDA培养基培养,结果显示突变体与野生型菌株生长速率差异不显著;将突变体和野生菌株的菌饼接于PDB培养液中进行液体培养获得分生孢子,将分生孢子悬浮液接于洋葱内表皮,观察发现Pmk1基因的缺失不影响果生刺盘孢的产孢和芽管形成,但影响附着胞的形成,且附着胞产孢率为0。3.通过分生孢子悬浮液离体接种嘎啦的果实及叶片,发现,在果实表面有伤接种七天后,突变体可以正常形成圆褐色病斑,病斑直径约为2 cm,但是突变体接种处病斑未扩展;在苹果表面无伤接种十天后,野生型接种果实可以在表面形成零星的圆形病斑,而突变体未形成病斑;在叶片表面有伤及无伤接种,与果实有伤和无伤接种表型相似。证明Pmk1基因的缺失使得果生刺盘孢丧失了致病性。4.发现Pmk1基因参与果生炭疽菌细胞壁胁迫应答反应,调控高渗透胁迫应答,影响病原菌对生长环境的适应性。在含有200 ng/mL刚果红的PDA培养基上,突变体和野生型菌株生长速率存在差异,由此推断Pmk1基因参与到细胞壁胁迫应答;在含有四种高渗透胁迫因子(0.5M NaCl、0.5M KCl、1M Sorbitol、1M Sucrose)的PDA培养上,分别培养野生型及突变体菌株,发现突变体敏感性明显高于野生型,证明Pmk1基因参与高渗透胁迫应答反应,维持细胞壁的稳定。5.构建回复载体,通过原生质体转化对Pmk1突变体进行回复,共得到四株回补转化子;将回补转化子的菌饼接于PDB培养液中进行液体培养获得分生孢子,并将分生孢子悬浮液接于洋葱内表皮,18h后在显微镜下观察发现,回复突变体能正常形成附着胞。6.利用GFP分析Pmk1基因表达和亚细胞定位特征,在荧光显微镜下在分生孢子、芽管、附着胞、侵入菌丝等结构细胞核及细胞质中均可发出绿色荧光,证明该基因在细胞核和细胞质中均有分布。本研究初步分析了果生炭疽菌Pmk1基因的功能,证实Pmk1基因是调控病菌附着胞发育和致病的关键基因。