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研究背景阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是一种以渐进性记忆减退、认知功能障碍以及其他神经精神症状和行为障碍为特征的神经系统退行性疾病,目前病因和发病机制尚未明确,亦无特效治疗药物。Sirtuin3（SIRT3）属于Sirtuin基因家族成员,具有广泛的生物功能,可调控多种疾病的病理过程。但SIRT3与AD的关系目前鲜有报道。本课题组前期研究证实小胶质细胞激活产生的炎性损伤诱导神经干细胞（Neural stem cell,NSC）凋亡,SIRT3可通过减轻氧化应激和炎症损伤、改善线粒体功能,发挥神经保护作用。在此基础上,我们推测SIRT3发挥神经保护作用可能通过与Wnt信号通路关键分子Dishevelled（DVL）蛋白相互作用,调控DVL水平,在β-淀粉样蛋白（Beta-amlyoidprotein,Aβ）介导小胶质细胞激活致NSC凋亡过程中发挥神经保护作用。本课题可望丰富SIRT3生物学功能,揭示SIRT3介导Wnt信号通路的机制提供新观点,为AD等神经退行性疾病临床治疗和药物干预提供新靶点。方法通过构建Transwell系统共培养小鼠神经干细胞C17.2（NSC）和小胶质细胞BV-2（Microglia,MG）,共培养系统中添加10μMAβ作用与两种细胞,MG被激活,建立小胶质细胞激活致NSC凋亡的共培养模型。设置对NSC进行10μM NAD+预处理、SIRT3过表达或干扰、转染DVL质粒或siRNA的实验条件,利用Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率。采用Western blotting检测相关基因蛋白表达水平,条带灰度使用Image J软件进行半定量分析。采用qRT-PCR检测相关基因mRNA表达水平。采用免疫沉淀技术验证SIRT3与DVL蛋白质相互作用。结果1、外源性NAD+对NSC凋亡及SIRT3与Wnt信号通路分子表达的影响试验分为C17.2单独培养组（control组）、NAD+作用于C17.2（NAD+组）、Aβ作用于共培养的BV-2和C17.2细胞模型组（model组）、NAD+预处理2h后Aβ作用于共培养的BV-2和C17.2细胞组（NAD+预处理组）。通过研究我们发现:与Control组比较,Model组NSC凋亡率显著升高（P＜0.01）,SIRT3、DVL2、DVL3、GSK3β蛋白表达量降低（P＜0.01）,但NAD+组NSC凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）,SIRT3、DVL2、DVL3、GSK3β、p-GSK-3β蛋白表达量升高（P＜0.01）;与Model组比较,NAD+预处理组NSC凋亡率显著降低（P＜0.01）,SIRT3、DVL2、DVL3、GSK3β、p-GSK-3β蛋白表达量升高（P＜0.01）。NAD+上调 SIRT3、DVL2、DVL3、GSK3β、p-GSK-3β蛋白表达（P＜0.01）,且随 NAD+作用时间变化。说明NAD+降低小胶质细胞激活致NSC凋亡率,并能上调SIRT3、DVL2、DVL3、GSK3β、p-GSK-3β蛋白表达量。2、NSC SIRT3和DVLs对Aβ介导小胶质细胞激活致NSC凋亡的影响从过表达和干扰DVLs正反两方面研究NSC DVL是否介导SIRT3在小胶质细胞激活致NSC凋亡中的作用。试验分为C17.2单独培养组（control组）、Aβ作用于共培养的BV-2和C17.2细胞模型组（model组）、SIRT3过表达组（SIRT3组）、SIRT3 过表达+DVLs siRNA 干扰组（SIRT3+siDVLs 组）、SIRT3 shRNA干扰组（shSIRT3 组）、SIRT3 shRNA 干扰+DVLs 过表达质粒组（shSIRT3+DVLs组）。结果显示,与Model组比较,SIRT3组NSC的细胞凋亡率显著减小（P＜0.01）,与SIRT3组比较,SIRT3+siDVLs组NSC凋亡率显著增大（P＜0.01）;与Model组比较,shSIRT3组NSC凋亡率显著增大（P＜0.01）,与shSIRT3组比较,shSIRT3+DVLs组NSC凋亡率显著减小（P＜0.01）。说明DVL可能参与SIRT3对小胶质细胞激活致NSC凋亡的影响过程。3、SIRT3对DVLs表达的调控作用及蛋白质相互作用在C17.2 NSC中过表达SIRT3能上调DVL2、DVL3蛋白表达水平和DVL1/2/3 mRNA 表达水平（P＜0.01）,干扰 SIRT3 后则能下调 DVL2、DVL3蛋白表达水平和DVL1/2/3mRNA表达水平（P＜0.01）;HEK293细胞中进行转染后,3HA-SIRT3免疫沉淀复合物中可检测到3Flag-DVL1、3Flag-DVL2、3Flag-DVL3蛋白,而在C17.2NSC中,内源性SIRT3免疫沉淀复合物中可检测到DVL2和DVL3蛋白。说明SIRT3可调控DVLs表达水平,并能与之结合。结论外源性NAD+可降低Aβ介导的小胶质细胞激活引起的NSC凋亡率,上调NSC细胞内SIRT3、DVL2、DVL3、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达量,且与作用时间具有相关性。在Aβ介导小胶质细胞激活致NSC凋亡的条件下,NSC DVLs过表达可缓解SIRT3缺少后引起的NSC凋亡增加,而干扰DVLs则可逆转SIRT3过表达后引起的NSC凋亡减少,促进NSC凋亡。SIRT3可调控DVLs表达水平,并能与之结合。研究结果首次揭示SIRT3与DVL的联系,为改善NSC生存微环境提供新的认识,为AD等神经退行性脑疾病的临床治疗与创新药物研发提供新靶标。