论文部分内容阅读
禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可引起家禽严重的呼吸道感染和全身性疾病,严重威胁家禽业的健康发展。另外,APEC属于肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli,ExPEC),其与人源ExPEC具有高度的同源性及相似的致病机制,可作为毒力基因与耐药基因的储库,具有潜在的公共卫生意义。在感染过程中,APEC一方面通过分泌系统发挥作用,另一方面通过调控系统控制毒力因子适时表达,促进其生存及致病。分泌系统是致病菌进化过程中形成的特定毒力因子,其可通过分泌效应因子扰乱宿主免疫应答反应,从而发挥致病作用。病原菌通过双组分系统感应外界环境,进而调控基因适时表达,促进其生存及致病。本实验室前期研究表明,大肠杆菌III型分泌系统2(E.coli Type III secretion system 2,ETT2)和Ⅵ型分泌系统2(TypeⅥsecretion system 2,T6SS2)存在并参与APEC的胞内存活、菌间竞争能力等致病过程。然而,ETT2效应因子的致病作用及T6SS2的调控机制尚不清楚。因此,本研究筛选和鉴定ETT2的效应因子,并分析效应因子EspE3对APEC致病性的影响;另外,解析了双组分系统Cpx R调控T6SS2增强APEC适应性及毒力的分子机制。由于分泌系统及调控系统对细菌毒力的重要性,使其成为颇具前景的疫苗及药物靶点。在耐药病原菌不断出现、抗生素治疗面临挑战的情况下,解析ETT2效应因子和双组分系统的分子致病机制,可为新型抗菌药物设计提供新思路及药物靶点,具有重要的现实意义。1.禽致病性大肠杆菌ETT2效应因子的筛选及鉴定为了筛选APEC ETT2的效应因子,本研究利用Red同源重组技术构建了APEC FJ1B菌株的ETT2核心基因eiv C缺失株,并通过荧光定量PCR方法分析ETT2核心组分在不同生长时期的表达水平,摸索最佳取样时间。然后,根据最佳培养条件提取FJ1B和ΔeivC的分泌蛋白,通过比较蛋白质组学方法结合生物信息学筛选鉴定ETT2效应因子。最后,通过Western blot、克隆表达、酶活试验分析效应因子的功能。结果显示,成功构建了ETT2核心基因eivC缺失株,且发现ETT2不同操纵子的表达趋势一致,其在生长平台期明显上调表达。通过非标记定量蛋白质组学技术鉴定到鉴定到肽段9845个,蛋白质组数1322个,其中差异蛋白725个。生物信息学分析发现EspE3包含亮氨酸重复序列(LRR),编码疑似E3泛素连接酶。Western blot分析表明EspE3是ETT2的效应因子。原核表达、纯化及体外泛素化试验结果显示,效应因子EspE3具有E3泛素连接酶活性,且催化K63位点的多聚泛素化。通过APEC ETT2效应因子的筛选鉴定,为解析ETT2的分子致病机制奠定基础。2.ETT2效应因子EspE3对禽致病性大肠杆菌毒力的影响为分析ETT2效应因子EspE3对禽致病性大肠杆菌毒力的影响,利用Red同源重组系统及互补质粒构建APEC FJ1B菌株的esp E3基因缺失株及互补株,然后分析EspE3对APEC的生长特性、运动性、黏附侵袭能力、动物致病力等的影响。另外,分别以APEC菌株感染及espE3真核表达质粒转染细胞,通过荧光定量PCR分析效应因子EspE3对宿主细胞炎性因子IL-1β、IL-8表达的影响,并利用GST pull-down方法筛选鉴定EspE3的互作蛋白。结果显示,缺失espE3基因不影响APEC的生长速度、运动性及细胞侵袭能力;但是EspE3能促进APEC的细胞黏附能力、体内定殖能力及致病力。细胞炎性因子检测结果显示效应因子Esp E3能够抑制宿主细胞炎性因子IL-1β、IL-8的表达。GST pull-down筛选到了77个EspE3的疑似互作蛋白,其功能有待深入研究。分析效应因子Esp E3对APEC致病性的影响,为解析ETT2的致病机制提供参考。3.双组分系统Cpx R调控T6SS2促进禽致病性大肠杆菌毒力的分子机制为分析双组分系统Cpx R调控APEC毒力的分子机制,利用Red同源重组技术及互补质粒构建了cpxR基因缺失株、互补株及Cpx系统激活菌株,并分析CpxR对APEC生长特性、运动性、生物被膜形成能力、抗血清杀菌能力、药物敏感性、菌间竞争能力、细胞黏附侵袭能力和动物致病力等方面的影响。然后,利用荧光定量PCR、Western blot及β半乳糖苷酶试验分析CpxR对T6SS2表达的调控作用;进一步通过凝胶迁移试验(EMSA)分析CpxR与T6SS2hcp2B启动子序列的结合情况。结果表明,缺失cpxR基因不影响APEC的生长速度、运动性、生物被膜形成能力和黏附能力;但是,CpxR促进APEC的耐药性、抗血清杀菌能力、菌间竞争能力、细胞侵袭能力及致病力。分析发现,CpxR可以促进T6SS2 hcp2B操纵子基因的转录及表达;启动子活性分析及EMSA证实了Cpx R可以直接结合hcp2B基因的启动子区域发挥调控作用。通过揭示双组分系统Cpx R调控T6SS2的分子机制,为阐明APEC的适应性和毒力提供理论基础。