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红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）是我国引进的优良淡水经济虾类,随着养殖规模的扩大,细菌性疾病愈加严重,特别是副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）的感染最为普遍。了解水生环境中病原微生物和宿主的相互作用,开展红螯螯虾抗副溶血弧菌感染分子机制的研究,能深入了解红螯螯虾抗感染的免疫机制,为选育优质高抗个体奠定基础。本研究在实验室条件下,建立副溶血弧菌感染红螯螯虾的动物模型,解析感染过程中体液免疫酶活力的时间梯度变化及其肝胰腺组织的病理变化,对比研究攻毒后易感组、抗感染组和对照组之间的转录组和代谢组差异,对Toll and Imd免疫信号通路中富集的差异基因,尤其是Relish和TRAF6基因进行了功能验证,探究了红螯螯虾抗副溶血弧菌感染的免疫调控机制。主要研究方法与结果如下:（1）用不同浓度的副溶血弧菌对红螯螯虾进行实验室急性攻毒试验,重复试验后确定了其24小时的半数致死量LD50为4.0×10~6 CFU/m L,此浓度下红螯螯虾的死亡率在12-24小时达到最大值,24小时后几乎保持不变。分别收集副溶血弧菌感染后6、12、24、48和72小时虾的血清,进行体液免疫相关酶的活力检测,结果显示:在弧菌感染的6-72 h过程中,螯虾的碱性磷酸酶（AKP/ALP）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）和总蛋白活性均显著低于对照组（P＜0.05）;而溶菌酶（LZM）的活性在感染期却显著高于对照组（P＜0.05）;酸性磷酸酶（ACP）和铜蓝蛋白（Cp）活性在24小时显著高于对照组（P＜0.05）。感染24小时内,红螯螯虾的死亡率持续升高,副溶血弧菌感染损伤了虾的氧化应激反应体系,导致部分氧化酶如PPO、SOD和总抗氧化能力（T-AOC）的活性被抑制,出现病理反应。说明弧菌感染一方面抑制了免疫相关氧化酶的活性,导致总抗氧化能力（T-AOC）和总蛋白活性显著降低;另一方面激活了溶菌酶的活性,增强了螯虾的免疫防御反应能力。（2）分析不同时间点（6 h、12 h、24 h、48 h、72 h）肝胰腺组织的病理性变化:与对照组相比,感染后6小时的肝胰腺细胞结构正常,且组织连接紧密,中心管腔呈星状排列。感染后12小时,病变开始出现在肝胰腺的中心腔,星形结构不规则收缩。24小时,病变组织恶化,腔内结构变大,边缘变薄。48小时,星形结构几乎消失,空泡面积增加。72小时,病变有所改善,中心腔开始恢复星形结构,但空泡的数量仍然很多。结果提示:副溶血弧菌感染时,肝胰腺是主要的靶器官,在不同时间段,其病理损伤有明显差异,推测副溶血弧菌的主要发病时间在病菌侵染后的12-24小时时间段。（3）副溶血弧菌感染后的RNA-seq分析:随机收取24小时濒死个体为易感组（S）;无明显临床症状的个体为抗感染组（A）;注射PBS的个体为对照组（C）。每组随机抽取6只虾,每两只虾混样进行高通量测序,构建成9个基因文库进行对比测序分析。在S与C比较中,发现了3,678个差异表达基因（P＜0.05）;在A与C比较中,发现了2,516个差异表达基因（P＜0.05）;在S与A比较中,发现了3,523个差异表达基因（P＜0.05）。在GO和KEGG数据库分析中,发现32个GO过程存在显著差异（P＜0.05）。而在易感组和抗病组比较中差异基因显著富集到淀粉和蔗糖代谢、氨基酸-t RNA的生物合成、抗原处理和呈现、吞噬体、甘油磷脂代谢、细胞凋亡、果糖和甘露糖的代谢等信号传导通路（P＜0.05）。副溶血弧菌感染激活的螯虾的免疫相关信号传导通路主要包括:霍乱弧菌感染、吞噬体、溶菌酶、氧化磷酸化、抗原处理和呈现、细胞凋亡和Toll样受体信号传导通路（P＜0.05）。（4）代谢组学研究结果显示:抗感染组（Cq AG）、易感组（Cq SG）和对照组（Cq CG）在正离子模式下共发现887个代谢物,其中,Cq SG与Cq AG的差异代谢物有101个;Cq SG和Cq CG的差异代谢物有283个;Cq AG和Cq CG的差异代谢物有224个。正离子模式下的差异代谢物显著富集到嘌呤代谢、嘧啶代谢、β-丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、c GMP-PKG信号通路、Fox O信号传导途径、PI3K-Akt信号通路嗅觉信号转导、嘌呤代谢通路、多巴胺能突触和赖氨酸的降解等代谢通路（P＜0.05）。负离子模式下共有代谢物465个,其中Cq SG与Cq AG的差异代谢物有63个;Cq SG与Cq CG的差异代谢物有133个;Cq AG和Cq CG的差异代谢物有120个（P＜0.05）。负离子模式下的差异代谢物显著富集到醌的生物合成、神经活性配体与受体的相互作用、溶酶体、谷胱甘肽代谢、氧化性磷酸化、氮素代谢、HIF-1信号通路、坏死和脂肪细胞中脂肪分解的调节等代谢通路（P＜0.05）。而易感组与抗病组的差异代谢物显著富集到谷胱甘肽的代谢、氨基酸t RNA的生物合成、氮素代谢、氧化性磷酸化、HIF-1信号传导途径、PI3K-Akt信号通路和嘌呤代谢等信号通路（P＜0.05）。提示,在副溶血弧菌感染时,机体的内环境稳态被破坏,为应对弧菌感染机体内部的相关物质ATP、Alanyltyrosine和ITP等出现了差异性代谢,肝胰腺的多个代谢通路被激活。（5）基于无参考转录组的数据分析,本研究组装了Toll and Imd信号通路中的Relish,TRAF6,Akirin和IRF4基因。通过序列分析,设计敲降干扰位点,分析了Relish和TRAF6个基因的干扰对虾抗副溶血弧菌感染的影响。结果显示:Relish基因488位点的干扰序列1μg/g进行螯虾肌肉注射,结果显著抑制了Relish基因的转录（P＜0.05）;TRAF6基因959位点的干扰序列按2μg/g剂量肌肉注射,显著抑制TRAF6基因的转录（P＜0.05）;Relish和TRAF6基因的敲降都会影响Akirin基因的转录。进一步设计Akirin敲降位点,发现基因504位点的干扰序列按1μg/g肌肉注射螯虾,可显著抑制Akirin基因的转录（P＜0.05）。三个基因的干扰显著提高了副溶血弧菌的致死性,与此同时肝胰腺组织的损伤加重。Relish基因的RNAi显著抑制了IRF4、Laccase、ALF、NF-κB和Lectin基因的转录（P＜0.05）;TRAF6基因的RNAi显著抑制SOD1、IRF4、Laccase和ALF基因的转录（P＜0.05）;Akirin基因的干扰导致IRF4、ALF、Lectin和NF-κB基因的显著下调（P＜0.05）。但三个基因的干扰不会抑制ALP、Cathpsin和Lysozyme基因的转录。本研究发现,三个基因的干扰都显著抑制IRF4的转录。原核表达IRF4蛋白,并进行活体注射,结果显示:在注射50μg重组蛋白后4小时,肝胰腺组织中的弧菌载菌量最低（P＜0.05）,其次是100μg和25μg。但这三个注射剂量都不会影响血淋巴中副溶血弧菌的载菌量。三个注射剂量的重组蛋白都会引起ALF、Laccase和Lysozyme基因的显著上调（P＜0.05）。综上所述:副溶血弧菌感染红螯螯虾时,会损伤肝胰腺组织,导致相关氧化酶活性显著降低,与此同时,副溶血弧菌会激活螯虾肝胰腺等相关基因的差异表达,产生相关差异性代谢物质,并激活Relish、TRAF6和Akirin基因作为调控因子在抵抗副溶血弧菌感染过程中调节相关免疫物质参与免疫反应,重组的Cq IRF4蛋白体内注射,会刺激部分免疫基因的显著上调,抑制肝胰腺组织中副溶血弧菌的载菌量。本研究完善了红螯螯虾抗副溶血弧菌感染时的转录组和代谢组数据;探究了Toll and Imd信号通路在螯虾抗弧菌感染过程中的调节机制,补充了螯虾抗细菌感染的免疫调控网络信息。