海洋真菌Stachybotrys longispora FG216代谢纤溶活性化合物FGFC1的生源合成途径研究

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海洋真菌可以分离得到结构新颖的化合物,主要包括聚酮类、生物碱类、肽类、萜类、甾体类、内酯类等,有抗肿瘤、溶解血栓、抗菌等生物活性,有发现创新药物的价值。基于丝状真菌Stachybotrys longispora FG216代谢纤溶活性化合物FGFC1以及Stachybotrys产出多种活性化合物的研究基础,为了探索稀有菌株Stachybotrys longispora FG216的生物学特性以及物种同源信息,进行基因生物信息学分析和生物活性化合物代谢途径的生物信息学分析,获得基因组学相关信息、挖掘FGFC1代谢相关基因和调控生物活性化合物产量。采用de novo测序技术分析Stachybotrys longispora FG216基因组部分序列,基于基因组学组装分析得到605条基因组序列,总碱基长度为45 622 830 bp,基因组覆盖度为100%,平均覆盖深度为48.87,不存在GC偏向性,组装结果已提交至国家微生物科学数据中心编号为NMDC60016264。预测得到13 329条编码基因,占基因组组装总碱基数目的46.58%,共检测到169条nc RNA。KEGG数据库注释8 422个基因富集在379代谢通路中,KOG进行注释匹配到8 460条基因序列,共有7 714个基因成功获得GO功能注释,CAZy注释共有2 847个基因匹配到与碳水化合物功能相关的酶。基因组数据对比显示Stachybotrys longispora FG216拥有最少的Scaffolds为605,和最多的CDS以及最长的碱基长度45.6 Mb。Stachybotrys的核心基因共有7325个基因家族占基因家族总数目的比列为71.44%,发现4个与黄曲霉毒素生物合成过程相关的功能基因。Stachybotrys longispora FG216的独有基因有448个,其中发现4个吲哚乙酰胺水解酶活性相关的功能基因。基因组间重叠簇热图显示Stachybotrys longispora FG216与Stachybotrys chlorohalonata IBT 40285基因组的相似性最高。antiSMASH软件预测Stachybotrys longispora FG216基因组共得到101个基因簇,匹配到18个已知化合物,其中Cluster 57可以编码异吲哚啉酮的合成。蛋白互作网络图显示TRP1、TRP和COQ1属于核心蛋白。PCR扩增出Sl HMGCR(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase)基因片段,长度为3 556 bp编码1185个氨基酸,预测分子量为127.95 k Da,等电点为7.38,属于疏水性膜蛋白,具有高度的功能保守性,属于Ⅰ类HMGCR家族,包含两个NADP(H)结合区域和一个HMG-Co A结合区域。鸟氨酸可以显著性的增加菌体的生长水平,同时菌丝体形成明显紧实交联的球状结构,菌丝系成簇状,较为发达。鸟氨酸可以刺激Stachybotrys longispora FG216胞内小分子蛋白的表达,相应提高蛋白丰度;显著提高Sl HMGCR基因表达水平。结果显示Lovastatin抑制菌体生长量具有浓度依赖关系,随着浓度的增高抑制效果增强,是Stachybotrys longispora FG216生长的特异抑制剂。Lovastatin 100μM和200μM处理组的菌丝体形成类似于海绵变成松散的不规则状,菌丝系也呈松散分布;Lovastatin 100μM没有体现出FGFC1产量抑制效果,而Lovastatin 50μM处理对FGFC1的产量展示出最高的抑制性;Lovastatin对沉默蛋白的表达没有表现出促进作用;Lovastatin 100μM处理组起到提高Sl HMGCR基因表达水平的作用,其他浓度组均表现出抑制效果,Lovastatin 200μM有着非常显著的抑制效果。结合真菌复杂的生物体系和多样的次级代谢途径,通过以上结果可以得到外源物质的加入可以通过影响菌体生长水平、菌体形态变化、沉默蛋白表达、次级Sl HMGCR的表达水平进而作用于最终产物FGFC1的合成。通过对甲羟戊酸途径限速酶HMGCR进行Lovastatin特异性抑制剂处理,结果显示对最终产物FGFC1有显著性抑制效果。由此可以得出FGFC1由甲羟戊酸途径合成并被HMGCR蛋白酶调控。
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