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结肠癌是临床上最常见的胃肠道恶性肿瘤之一。近些年来,在世界范围内结肠癌的发病率和死亡率都居高不下。结肠癌的发生原因复杂,诸种因素如环境、遗传、饮食、生活方式等都与其有关。近年来随着分子生物学和临床诊断技术的发展,结肠癌的早期诊断和治疗取得了一定的进展,但患者的整体生存率并没有明显提高,约20-25%的结肠癌患者有远处转移,预后较差。此外,结肠癌进展的分子机制尚不完全清楚。因此,研究结肠癌发生发展的潜在机制,寻找参与肿瘤生长和转移的关键分子,以提高结肠癌的治疗效果和预后,已成为当前研究的热点。研究表明,除了蛋白质和微小RNA（micro RNA,miRNA）以外,长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,lnc RNAs）也参与了结肠癌发生发展的调控。在肿瘤进展过程中,lnc RNAs的失调是一种常见现象,lnc RNAs表达谱的异常与各种恶性肿瘤的发生密切相关。LINC00941又称MSC上调因子,是一种位于人类基因组12p11.21区域的新型lnc RNA。有研究证实,它能促进胃癌、肺癌等多种肿瘤的生长和转移。然而,LINC00941在结肠癌中的生物学效应及可能的分子机制尚不清楚,因此有必要探讨其在结肠癌中的作用特点以发现结肠癌基因治疗的新靶标。本研究进行了体外和体内实验,探讨LINC00941在结肠癌中的表达水平、生物学效应及可能的机制。结果表明,LINC00941通过海绵化miRNA调节miR-205-5p的表达,进而正向调控MYC的表达,促进结肠癌的发生发展,为lnc RNAs在结肠癌诊断和治疗上的应用提供了新的依据和思路。第一部分LINC00941在结肠癌组织和细胞中的表达方法1、收集郑州大学附属肿瘤医院经手术切除、且经病理组织学确诊的42例结肠癌组织和与其配对的癌旁正常结肠组织标本。2、培养正常结肠上皮细胞系NCM460及LS174T、HCT116、CT26、HCT8、HCT29、SW480、Lo Vo 7种不同的结肠癌细胞系。3、采用qRT-PCR方法分别检测结肠癌和癌旁正常结肠组织中LINC00941的表达差异;以及NCM460细胞系和7种不同结肠癌细胞系中LINC00941的表达差异。4、统计学分析:以均数±标准差表示实验所有数据。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素或多因素方差分析,运用SPSS 20.0软件对数据进行分析。P＜0.05被认为差异有统计学意义。结果1、相较于癌旁正常结肠组织标本,结肠癌组织标本中的LINC00941表达水平显著升高。2、相较于NCM460细胞系,7种结肠癌细胞系中的LINC00941的表达水平明显升高,尤其HCT116和Lo Vo细胞系中更为显著。结论LINC00941在结肠癌组织和细胞中均表达,且表达水平明显高于癌旁正常结肠组织和正常结肠上皮细胞。第二部分LINC00941对结肠癌细胞生物学行为的影响方法1、选择LINC00941表达水平较高的HCT116和Lo Vo细胞进行培养,并分别转染过表达LINC00941的质粒载体和空载体,构建稳定过表达LINC00941的细胞系和阴性对照细胞系。2、利用siRNA干扰LINC00941的表达,将siLINC00941-1、siLINC00941-2和阴性对照si-NC分别转染HCT116和Lo Vo细胞,建立LINC00941沉默的结肠癌细胞系和阴性对照细胞系。3、稳定转染后采用qRT-PCR法检测结肠癌细胞中LINC00941的表达情况;CCK-8实验和Transwell实验检测结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。4、建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察并测量肿瘤体积和重量的变化;进一步建立裸鼠结肠癌肺转移模型,处死裸鼠后计数肺转移结节。5、统计学分析:以均数±标准差表示实验所有数据。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素或多因素方差分析,运用SPSS 20.0软件对数据进行分析。P＜0.05被认为差异有统计学意义。结果1、qRT-PCR结果显示:与空载体转染的阴性对照细胞系相比,经过表达LINC00941质粒载体稳定转染的HCT116和Lo Vo细胞中LINC00941的表达水平明显升高。另外,与si-NC转染的阴性对照细胞相比,经siLINC00941-1、siLINC00941-2转染后的HCT116和Lo Vo细胞中LINC00941的表达水平明显降低。2、CCK-8实验结果显示:与空载体转染的阴性对照细胞系相比,经过表达LINC00941质粒的载体稳定转染后,HCT116和Lo Vo细胞的增殖能力明显升高。与转染si-NC的阴性对照细胞相比,转染siLINC00941-1、siLINC00941-2的HCT116和Lo Vo细胞增殖能力明显降低。3、Transwell实验结果显示:与阴性对照相比,HCT116和Lo Vo细胞经过表达LINC00941质粒的载体转染后,其迁移和侵袭能力明显增强;而转染siLINC00941-1、siLINC00941-2后,其迁移和侵袭能力明显减弱。4、裸鼠体内实验结果显示:在裸鼠皮下移植瘤模型中,与阴性对照组sh NC相比,sh LINC00941组裸鼠体内的肿瘤体积和肿瘤重量明显降低,且肿瘤生长速度也明显减慢。在裸鼠结肠癌肺转移模型中,sh LINC00941组裸鼠肺转移结节数目明显少于阴性对照组sh NC。结论在体内外过表达LINC00941均能够促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭;而沉默LINC00941可抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。第三部分LINC00941影响结肠癌细胞生物学行为的分子机制方法1、采用RNA-FISH实验检测LINC00941在结肠癌细胞中的细胞定位。2、将LINC00941与miR-205-5p结合的3’UTR序列和突变序列构建入pmir GLO载体,分别为LINC00941-wt（野生型）载体、LINC00941-mut（突变型）载体。将LINC00941-wt或LINC00941-mut与miR-205-5p模拟物或miR-205-5p抑制剂共转染结肠癌细胞,以NC模拟物或NC抑制剂为阴性对照。应用双荧光素酶报告分析实验检测荧光素酶活性,验证LINC00941与miR-205-5p之间是否存在靶向结合;并采用RIP实验进一步证实LINC00941与miR-205-5p的关系。3、将siNC、siLINC00941、siNC+miR-205-5p inhibitor、siLINC00941+miR-205-5p inhibitor分别转染Lo Vo细胞,进行实验分组。采用qRT-PCR方法检测四组结肠癌细胞中miR-205-5p的表达水平。采用CCK-8实验检测四组结肠癌的增殖活力;Transwell法检测四组结肠癌细胞的迁移和侵袭能力。4、将MYC与miR-205-5p结合的3’UTR序列和突变序列构建入pmir GLO载体,分别为MYC-wt（野生型）载体和MYC-mut（突变型）载体,并将MYC-wt或MYC-mut分别与NC mimics、miR-205-5p mimics、miR-205-5p mimics+空载体、miR-205-5p mimics+LINC00941质粒载体共转染Lo Vo细胞,应用双荧光素酶报告分析分别检测荧光素酶活性,验证MYC与miR-205-5p之间的直接结合。5、将转染细胞进行分组:NC、miR-205-5p、miR-205-5p+vector、miR-205-5p+LINC00941、si-NC、si-LINC00941,分别采用qRT-PCR、Western blot方法检测MYC的表达情况。6、统计学分析:以均数±标准差表示实验所有数据。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素或多因素方差分析,运用SPSS 20.0软件对数据进行分析。P＜0.05被认为差异有统计学意义。结果1、RNA-FISH实验结果显示:LINC00941主要定位于结肠癌细胞的细胞质中。2、双荧光素酶报告实验结果显示:与阴性对照相比,当miR-205-5p过表达时,LINC00941-wt转染细胞的荧光素酶活性降低;而当miR-205-5p沉默时,LINC0094-wt转染细胞的荧光素酶活性升高。然而,无论miR-205-5p过表达或沉默,LINC00941-mut转染细胞的荧光素酶活性均无明显变化。另外,在MYC-wt与miR-205-5p mimics共转染的细胞中荧光素酶活性降低,但在MYC-mut与miR-205-5p mimics共转染的细胞中荧光素酶活性无明显变化。此外,在MYC-wt与miR-205-5p mimics+LINC00941共转染的结肠癌细胞中实现了miR-205-5p mimics所致荧光素酶活性抑制作用的逆转。3、RIP实验结果显示:Ag O2免疫沉淀物中同时可以检测到LINC00941和miR-205-5p的表达,然而在下调miR-205-5p的表达后,Ag O2免疫沉淀物中检测到的LINC00941的表达量也显著下调。4、qRT-PCR结果显示:结肠癌细胞转染siLINC00941后miR-205-5p表达明显增加,而转染miR-205-5p抑制剂后miR-205-5p表达减少。5、CCK-8和Transwell实验结果显示:LINC00941表达下调使结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力受到抑制,而沉默miR-205-5p后可部分逆转此抑制效应。6、qRT-PCR和Western-blot实验结果显示:对比于阴性对照组,miR-205-5p组、si-LINC00941组的MYC m RNA和蛋白质的表达水平均显著下降;miR-205-5p+LINC00941组与miR-205-5p+vector组相比,MYC m RNA和蛋白质的表达水平显著升高。结论LINC00941作为ceRNA吸附结合miR-205-5p而上调MYC的表达,通过作用于miR-205-5p/MYC轴促进结肠癌的发生发展。