内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）移植是治疗四肢缺血和心血管疾病的新策略。骨髓来源的单个核细胞、血液来源的祖细胞、间充质干细胞及胚胎干细胞都可以作为诱导内皮细胞（endothelial cells，ECs）的种子细胞。由于胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）可以在体外条件下模拟胚胎发育的过程，用于关键信号通路及调控分子的研究，进而受到越来越多的关注。目前，人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）向ECs诱导分化主要有三种策略，即添加生长因子、低氧及层流剪切力（laminar shear stress，LSS）的诱导。大量文献报道表明添加重组人内皮细胞生长因子（recombinant human vascularendothelial growth factor，rhVEGF）、重组人碱性成纤维细胞生长因子（recombinedhuman basic fibroblast growth factor，rhbFGF）等生长因子及低氧诱导因子HIF1α可以调控hESCs向ECs的诱导分化。但是对LSS作用机制的研究并不是很多。LSS在体内条件下，主要是指血液在血管中流动时对血管壁产生的冲击力。ECs作为衬贴于血管内腔面的单层扁平细胞会响应血流的刺激发挥对血管的调控作用，包括对血管收缩和舒张的调节。ECs对血流刺激的响应就是对LSS的响应。已经有文献报道表明LSS在促进ECs分化及ECs功能调控过程中都发挥了重要作用。人atonal同源基因6（human atonal homologue6，Hath6）是在使用LSS处理人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）检测基因表达变化时被发现的。LSS处理后，Hath6的表达明显上调。初步的研究结果表明Hath6是ECs选择性表达的碱性-螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）转录因子，该转录因子家族成员在细胞的分化及胚胎发育形成中都有重要的调控作用。不仅如此，Hath6在人类一些高度血管化的组织中高表达，这提示Hath6作为ECs中响应LSS的转录因子，其有可能参与到血管的发生及调控中。LSS对ECs的分化及功能调控有重要作用，Hath6作为ECs中响应LSS的转录因子，这些进一步提示Hath6有可能参与到ECs的分化及功能调控中。为了验证我们的假设，在本课题中我们模拟LSS处理细胞，检测Hath6的表达变化；进一步建立过表达及下调表达Hath6的hESCs及ECs并在此基础上展开Hath6对ECs分化、功能调控及其作用机制的研究。首先，为研究Hath6对ECs诱导分化的影响，我们建立了一套hESCs起始向ECs诱导分化的三阶段诱导体系。在分阶段诱导分化的过程中，在诱导分化的第二阶段检测到内皮相关表面标志——CD31、 KDR和VE-cadherin的比例可以分别到达约16%、60%和10%，进一步功能的检测发现，该诱导分化阶段的细胞可以形成血管样结构，结合植物凝集素。进一步的诱导分化不仅仅可以获得更大量的细胞并且所得CD31单阳性细胞的比例进一步提高至30%以上，同时细胞具备吞噬LDL的能力。上述实验结果表明我们建立了一套二维培养条件下，无血清、成分明确的ECs诱导分化体系，这是我们开展下游研究工作的基础。其次，我们利用Q-PCR检测到hESCs自主分化及分阶段诱导内皮分化的过程中，内源性Hath6的表达呈现明显上调的趋势，与内皮特异性基因的上调表达呈正相关，这和我们的假设相一致。之后我们使用建立的过表达及下调表达Hath6的hESCs进行ECs的定向诱导分化，观察Hath6的表达变化对内皮分化的影响。Q-PCR的结果表明，同对照组相比，Hath6的过表达明显上调了内皮相关基因的表达，基因上调幅度均超过3倍；流式检测的结果表明，Hath6的过表达促进了CD31+、KDR+及CD31+/KDR+细胞亚群比例，统计分析的数据表明Hath6的过表达显著提高了上述细胞亚群比例约1.5倍并且差异具有统计学意义（p<0.05）；血管样结构形成实验的结果表明，Hath6的过表达显著促进了血管样结构的形成及Dil-Ac-LDL的吞噬。这些结果都表明Hath6的过表达可以显著促进ECs的分化。在Hath6下调表达组的实验中，我们检测到Hath6的下调表达明显抑制了内皮相关基因在mRNA及蛋白水平的表达，也明显抑制了血管样结构的形成和Dil-Ac-LDL的吞噬。这些结果表明Hath6对ECs的分化是必须的。综上所述，我们认为Hath6调控了ECs的分化。再次，我们对Hath6是否能够调控ECs的功能进行了验证。在建立了过表达及下调表达Hath6的ECs后，我们首先通过RT-PCR实验检测到，Hath6的过表达促进了成熟ECs中内皮相关基因的表达，该结果证明Hath6对其它内皮基因的表达有调控作用。随后我们通过血管样结构形成实验证实在成熟的ECs中，Hath6的过表达并不能够明显的促进血管样结构的形成，细胞增殖实验检测Hath6的过表达会明显抑制ECs的增殖。我们又进一步验证Hath6的过表达对细胞迁移的影响，结合Hath6对增殖的明显抑制作用，认为其过表达可以促进细胞的迁移。在Hath6下调表达组的实验中，检测到Hath6的下调表达会抑制内皮相关基因的表达，明显抑制血管样结构的形成（p<0.05），促进细胞的增殖并抑制细胞的迁移。这些结果都表明，Hath6促进了ECs的终末成熟。最后，在明确了Hath6对ECs的分化及功能调控作用后，我们开始思考Hath6的作用机制。Hath6作为响应LSS的转录因子，可能在响应LSS后通过调控基因的表达变化实现其对内皮功能的调控作用。推测作为Hath6下游的靶分子应该也会响应LSS，进一步发生表达水平的改变实现对ECs分化及功能的调控作用。此外，Hath6属于碱性-螺旋-环-螺旋转录因子家族成员，该家族成员通常通过结合靶基因启动子区域的E-box序列发挥转录调控作用，因此确定启动子区域的E-box也成为我们判断Hath6靶基因的标准之一。基于上述三个特点，我们初步筛选eNOS为Hath6的靶基因。有研究表明LSS处理后eNOS表达上调，并且其通过调控NO的产生对ECs的分化及功能调控都重要作用，最关键的一点是生物信息学的分析数据表明，eNOS基因上游启动子区域包含大量的E-box序列。因此在本部分的研究中，我们以eNOS为切入点展开Hath6作用机制的研究。首先我们使用LSS分别处理HUVECs及hESCs，检测到LSS处理后Hath6和eNOS在mRNA水平的表达均发生明显上调，HUVECs中分别上调6.2倍（p<0.001）和2.8倍（p<0.01）；hESCs中LSS处理8h后，Hath6的mRNA表达水平上调了3.6倍（p<0.05），LSS处理20h后上调至6.1倍（p<0.05），呈现明显的LSS处理时间依赖效应。之后通过Western blot验证了上调及下调表达Hath6的ECs及hESCs-ECs诱导分化过程中eNOS的表达变化是受Hath6调控的，进一步使用eNOS小分子抑制剂——L-NAME验证在Hath6-hESCs-ECs诱导分化体系中，添加L-NAME会明显降低由Hath6的过表达所致的内皮诱导分化效率的提高，最后使用LSS处理sh-Hath6-hESCs检测到同对照组相比，sh-Hath6-hESCs中eNOS的表达也被明显下调（p<0.001），这说明Hath6的下调表达降低了eNOS对LSS的响应。以上结果证明，Hath6作为响应LSS的转录因子，通过调控eNOS的表达水平进一步调控eNOS信号通路，实现其对ECs诱导分化及功能的调控作用。综上所述，Hath6的过表达对以hESCs为起始向ECs的诱导分化有明显的促进作用，其下调表达会明显抑制该过程的发生；在成熟的ECs中，Hath6可以调控ECs的功能；进一步作用机制的研究结果表明，Hath6作为转录因子通过调控eNOS的表达进而活化下游信号通路，实现其对ECs分化及功能的调控。当前，对LSS调控内皮分化及功能的作用机理研究的并不透彻，而对Hath6的研究为进一步深入理解LSS调控内皮分化及功能的具体作用机制提供了新的切入点；同时也首次明确了Hath6对内皮的作用功能并为该基因家族（ATOH8家族）调控胚胎发育提供了新的证据；也进一步为以hESCs起始，大量诱导获得内皮细胞提供了可能，从而对内皮细胞应用于缺陷组织的修复、血液病的治疗等提供了依据，并将为再生医学及临床应用提供更多的理论指导并产生深远影响。