视神经脊髓炎昼夜节律紊乱中星形胶质细胞Cx43-谷氨酸调控机制研究

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目的:本研究使用小鼠下丘脑视交叉上核(Suprachiasmatic nucleus,SCN)星型胶质细胞(Astrocyts,ASTs)制备视神经炎脊髓炎(Optic neuritis myelitis,NMO)细胞模型,试图探讨视神经脊髓炎谱系疾病(NMO spectrum disorder,NMOSD)免疫损伤和昼夜节律紊乱之间的关系,探索ASTs调控NMOSD昼夜节律的细胞分子机制,为NMOSD及其他昼夜节律紊乱提供可能干预的靶点和药物。方法:1.原代ASTs的NMO模型在鼠SCN的ASTs原代培养中加入人水通道蛋白4(Aquaporin-4,AQP4)抗体(5 ug/m L)及补体(10 ug/m L)制备NMO体外细胞培养模型,利用饥饿法进行调定生物钟时间,在特定时间点检测Cx43蛋白、谷氨酸、时钟基因Clock/Bmal1表达节律。将ASTs与原代神经元进行共培养,检测神经元VIP释放节律。2.Cx43抑制或诱导在鼠SCN正常和NMO ASTs模型中加入Cx43半通道阻滞剂-TAT-Gap19(20 u M)或Cx43诱导剂-亚油酸(Linoleic acid,LA,,50 u M)。3.谷氨酸受体抑制或添加在鼠SCN正常和NMO ASTs模型中加入谷氨酸NMDA受体(N-methyl-d-aspartate receptor,NMDAR)非竞争性拮抗剂-DQP-1105(20 u M)或谷氨酸(Glutamate,Glu,50 u M)。4.时钟基因Bmal1基因沉默将ASTs原代培养中,时钟基因Bmal1沉默后,检测各时间点免疫因子的变化情况。结果:1.AQP4抗体导致SCN ASTs的Cx43、谷氨酸、Clock/Bmal1基因m RNA表达/释放节律紊乱:与对照组相比,NMO组中SCN ASTs中Cx43(CT12 P<0.01;CT18,CT24 P<0.001)、谷氨酸(CT12,CT18 P<0.05;CT24 P<0.01)、Clock基因m RNA(CT12,CT18 P<0.05;CT24 P<0.001)、Bmal1基因m RNA(CT12 P<0.05;CT18 P<0.01;CT24 P<0.001)在主观夜(CT12-CT24)表达/释放减少。2.ASTs中Cx43调节谷氨酸释放节律:与对照组相比,NMO组中SCN ASTs的谷氨酸释放减少(P<0.001)。在对照组,加入Cx43蛋白阻滞剂(TAT-Gap19)使谷氨酸水平减少(P<0.0001);在NMO组,加入Cx43诱导剂(Linoleic acid)使谷氨酸水平增加(P<0.0001)。3.ASTs中谷氨酸影响神经元VIP释放节律:与对照组相比,NMO组中神经元VIP释放较少(P<0.001)。在对照组,加入谷氨酸受体拮抗剂(DQP-1105)使神经元VIP水平减少(P<0.05);在NMO组,增加谷氨酸使神经元VIP水平增加(P<0.0001)。4.ASTs中Cx43与时钟基因存在双向调节关系:(1)ASTs中Cx43影响时钟基因m RNA表达节律:与对照组相比,NMO组中Clock/Bmal1基因m RNA表达下降(P<0.0001)。在对照组,加入Cx43蛋白阻滞剂(TAT-Gap19)使Clock基因m RNA的表达减少(P<0.001)。在对照组,加入Cx43蛋白阻滞剂(TAT-Gap19)使基因m RNA的表达减少(P<0.0001);在NMO组,加入Cx43诱导剂(Linoleic acid)使Bmal1基因m RNA的表达增加(NMO+Linoleic acid组P<0.05;Blank组P<0.0001)(2)ASTs Bmal1基因影响Cx43表达节律:在小鼠ASTs Bmal1基因沉默实验中,实验组(Ad-sh-Bmal1)较阴性对照组(Ad-sh-NC组)Cx43表达减少(DQP-1105组P<0.01;Blank;TAT-Gap19;NMO+Linoleic acid;NMO+Glu组P<0.0001)。结论:1.AQP4抗体导致ASTs中Cx43、谷氨酸、Clock/Bmal1基因m RNA表达/释放节律紊乱。2.ASTs中Cx43调节谷氨酸释放节律。3.ASTs中谷氨酸影响神经元VIP释放节律。4.昼夜节律与炎症存在双向调节关系。
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