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背景和目的烷基化剂广泛存在于自然界中,是一类细胞毒性药物,在体内与生物分子DNA等结合,使其丧失活性。甲基磺酸甲酯（Methyl methanesulfonate,MMS）作为SN2型烷基化剂的代表,高剂量（75 mg/kg）单次腹腔注射可诱导小鼠视网膜感光细胞急性损伤。然而,高剂量MMS对肾脏、脑、胰腺等器官均具有明显的致畸作用,且视网膜感光细胞损伤程度严重,与临床上视网膜退行性疾病的慢性视网膜损伤不一致。因此,建立全身毒副作用小、特异性强的慢性视网膜感光细胞损伤模型,用于研究视网膜色素变性等疾病的感光细胞损伤机制及预防治疗更具有实际意义。外源性损伤可刺激表观遗传修饰发生重编排,通过调控染色质结构和基因转录,参与细胞生长发育、周期调节、信号转导等多种生命过程,导致视网膜生理和病理过程的改变。而表观遗传机制如何调控MMS诱导的视网膜损伤进程,目前还知之甚少。DNA甲基化是表观遗传修饰的一种,可以遗传给后代,在多种疾病发生发展中起重要的调控作用。研究证实,视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性及光照所致的视网膜感光细胞损伤,均伴随DNA甲基化水平升高,同时DNA甲基转移酶被激活,提示DNA甲基化异常可能是神经元细胞死亡的起始因子,抑制DNA甲基转移酶活性可能成为保护神经元的有效策略之一。然而烷基化剂MMS诱导视网膜感光细胞损伤是否也存在DNA甲基化修饰的改变,如果存在,又是如何调控损伤过程的,目前尚未见相关报道。本课题拟首先观察不同剂量MMS诱导视网膜感光细胞损伤模型中视网膜形态及功能的改变,选择MMS最佳诱导剂量建立慢性视网膜感光细胞损伤模型;进一步检测损伤视网膜的DNA甲基化谱及DNA甲基化相关调控因子的改变,筛选出与视网膜功能、疾病损伤密切相关的甲基化差异基因;采用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine,5-aza-dC）干预视网膜的DNA甲基化水平,探索DNA甲基化对MMS诱导视网膜损伤的调控作用及分子机制。为表观遗传修饰作为靶点,预防视网膜感光细胞的损伤,提供实验基础和理论依据。方法采用不同剂量MMS（75、50、37.5、18.75、9.375 mg/kg）分别进行单次腹腔注射,诱导小鼠视网膜感光细胞损伤,通过视网膜电图（ERG）、视网膜相干断层扫描（OCT）及视网膜组织病理学切片染色,评估不同剂量MMS对视网膜感光细胞损伤的程度及进程,选择最佳诱导剂量用于建立慢性视网膜感光细胞损伤模型。获取MMS处理后1～4周的小鼠视网膜组织,采用5-甲基胞嘧啶（5-methylated cytosine,5m C）抗体荧光标记细胞核内5m C,观察损伤后视网膜甲基化水平的变化,运用Western blot技术检测视网膜内DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs）及甲基化Cp G位点结合蛋白2（Me CP2）的表达。分别提取正常对照组及MMS处理后4w的慢性模型组小鼠视网膜的DNA及RNA,采用简化代表性亚硫酸氢盐测序（Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS）及转录组测序（RNA-seq）对两组视网膜的基因组甲基化程度及基因表达水平进行检测,统计两组之间的差异甲基化区域（Differentially Methylated Regions,DMRs）及差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）。将两种组学数据关联分析,筛选出与视网膜发育、功能维持、疾病损伤密切相关的差异基因,利用q-PCR对其进行m RNA水平验证。通过玻璃体注射DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dC（2μM,1μL）,改变视网膜内DNA甲基化相关调控因子的活性,观察其对MMS诱导视网膜损伤的功能及形态的影响,提取损伤后4w的视网膜蛋白及RNA,检测DNA甲基转移酶及甲基化差异基因的表达变化,验证DNA甲基化修饰对MMS诱导慢性视网膜损伤的调控作用。结果1.MMS诱导的小鼠视网膜感光细胞损伤呈时间剂量依赖型。MMS 75mg/（kg·体重）剂量处理组,视网膜损伤呈急性改变,处理后第7天视网膜感光细胞严重受损,外核层感光细胞仅剩2～3层,外节消失,视网膜功能丧失,ff ERG反应熄灭,与对照组相比差异显著（P＜0.0001）。MMS 50 mg/（kg·体重）剂量组视网膜感光细胞损伤呈慢性改变,至第4周外核层感光细胞余4～5层,外节消失,观察至12周无明显变化,维持慢性视网膜感光细胞损伤的稳定性,ff ERG各波形振幅中度下降,功能受损,与对照组相比差异显著（P＜0.001）。2.MMS诱导的慢性视网膜损伤模型特异性损伤感光细胞,肝、肾、脑等重要脏器HE染色与正常对照组相比未见明显异常。3.慢性视网膜感光细胞损伤后,外核层5m C荧光染色增强,DNA甲基化水平升高,伴有DNMT1及Me CP2蛋白表达升高。RRBS测序及RNA-seq关联分析,发现与视网膜发育、功能维持、疾病损伤密切相关转录因子Crx甲基化水平升高,同时m RNA表达水平下降。q PCR验证模型组Crx及下游基因的表达均较正常对照组下降。4.5-aza-dC玻璃体注射减轻了MMS对视网膜感光细胞造成的损伤,视网膜外核层厚度较模型组增加,外节形态部分恢复,视网膜功能有所好转。同时,5-aza-dC逆转了MMS诱导的DNMT1高表达,Crx及下游基因的m RNA水平上调。结论本课题通过MMS 50mg/（kg·体重）单次腹腔注射,成功建立小鼠慢性视网膜感光细胞损伤模型。该模型制备方法简单、稳定性好、可重复性高,且对全身重要脏器无明显毒副作用。MMS诱导的慢性感光细胞损伤伴有DNA甲基化修饰的改变,被DNA甲基转移酶DNMT1所调控;视网膜发育相关转录因子Crx的甲基化修饰在慢性视网膜感光细胞损伤过程中起着关键的作用。DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dC可降低DNMT1的表达,增加Crx的m RNA表达,促进视网膜感光细胞和外节的形态及功能部分恢复。