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目的:糖尿病视网膜病变是主要的致盲性疾病之一,且其致盲率呈上升趋势。视网膜新生血管的出现标志着病变进入增殖期,是致盲的主要原因之一。糖尿病视网膜病变的发病机制尚不明确。随着近年来研究的深入,糖尿病视网膜病变发病机制中炎性介质的作用倍受学者瞩目。基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是一类新近发现的具有趋化活性的细胞因子。新近的研究表明,SDF-1在诱导出生后血管发生中起关键作用,与糖尿病及其他缺血缺氧性视网膜病变存在密切联系。本课题利用糖尿病大鼠动物模型,通过免疫组织化学定位、定量分析,结合荧光实时定量RT-PCR技术和荧光免疫组织双标技术了解糖尿病状态下视网膜SDF-1表达情况及可能的调节机制,为阐明糖尿病视网膜病变的发病机制和防治新生血管的发生提供新的方向。
方法:
(1)一次性腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)60mg/kg,在健康成年wi staI’大鼠上诱导建立糖尿病动物模型。诱导成功后,糖尿病大鼠分别饲养2月和3月,作为DM2M组和DM3M组,健康成年wistar大鼠作为对照组(CON)。
(2)利用组织免疫化学和组织免疫荧光技术分别在正常大鼠和糖尿病大鼠视网膜上检测SDF-1蛋白的表达和定位。
(3)利用计算机软件Image-Pro Plus5.02测量 AOI和IOD,进行各组大鼠视网膜SDF-1表达的定量免疫组化研究(Q-IHC)。
(4)利用荧光实时定量RT-PCR技术分析糖尿病和正常大鼠视网膜SDF-1mRNA表达量的差别。
(5)利用免疫荧光双标技术检测视网膜上缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和SDF-1的表达情况。
结果:
(1)成功建立糖尿病大鼠的动物模型。
(2)免疫组织化学和免疫荧光化学显示:正常大鼠和糖尿病大鼠的视网膜内层均可见SDF-1的表达,主要位于内核层和节细胞,特别是节细胞层。与正常大鼠相比,糖尿病大鼠视网膜内层SDF-1阳性染色较强,范围也较广。
(3)定量免疫组织化学结果显示,糖尿病大鼠视网膜内层SDF-1表达较正常大鼠明显增加;而DM2M组和DM3M组组间差别无显著性。
(4)荧光实时定量RT-PCR显示DM2M组SDF-1拷贝数为2.3×10<-4>±1.2×10<-4>(X±s),CON组SDF-1拷贝数为2.9×10<-4>±1.0×10<-4>(X±s)。经管家基因βactin校正后DM2M组拷贝数为3.3×10<-2>±8.5×10<-3>(X±s),CON组为1.7×10<-2>±5.7×10<-3>(X±s)(t=2.33,Students t test),两组差别具统计学意义。
(5)组织免疫荧光双标可以发现糖尿病大鼠视网膜内层存在SDF-1和HIF-1 α两种蛋白的共表达;而健康大鼠仅有SDF-1表达。
结论:
(1)生理状态下,大鼠视网膜内层存在一定量的SDF-1表达。
(2)糖尿病状态下,视网膜内层SDF-1表达明显增加。
(3)糖尿病状态下视网膜内层SDF-1的增加可能与转录因子HIF-1有关。