前言结直肠癌(CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤,严重威胁着人类的健康。根据2018年世界卫生组织发布的全球肿瘤流行病统计数据(GLOBOCAN2018)结果显示结直肠癌排第三位。近30年发病率呈现出明显的下降,而在中国却表现为升高趋势。B细胞易位基因1(BTG1)是人TOB/BTG家族的成员。目前已有研究表明了BTG1基因具有多种的生物学功能,例如抑制细胞增殖、G0/G1期阻滞等等。但BTG1在结直肠癌方面的研究仍较少。在前期工作中,我们已经发现,使结直肠癌细胞中BTG1表达上调即BTG1过表达,可以显著抑制结直肠癌细胞增殖和肿瘤生长,并诱导其凋亡、衰老和分化。本研究主要目的是进一步观察BTG1对结直肠癌细胞侵袭和转移的影响,并尝试分析其抑制结直肠癌肿瘤细胞侵袭转移的相关分子机制,为临床治疗提供一定的科学依据。材料与方法1、第一部分:BTG1过表达对结直肠癌细胞黏附、迁移和侵袭能力的影响培养结直肠癌细胞株(HCT-116),将pc DNA3.1载体或者pc DNA3.1-BTG1表达质粒转染入HCT-116结直肠癌细胞,经G418处理后用蛋白印迹法(Western Blot)及RT-PCR法筛选出三组单克隆细胞(Clone32、Clone37和Clone40);MTT分别测定漂浮细胞和贴壁的细胞吸光度,计算细胞同质性和异质性黏附能力;用细胞划痕实验来检测细胞迁移能力。Transwell检测细胞的侵袭能力;此外,通过免疫荧光染色显微镜下观察片状伪足。2、第二部分:BTG1过表达对结直肠癌细胞表型分子表达的调节作用细胞培养方法同第一部分。细胞裂解、破碎、定量及变性后,用蛋白印迹法(Western Blot)测定c-jun、JNK、DJ-1、Twist、WAVE2、PI3K、snail及CEA的蛋白表达;提取细胞总RNA,RT-PCR法测定CEA指标的m RNA表达;通过ELISA法检测细胞抗CEA抗体滴度,检测CEA的分泌情况。3、第三部分:BTG1对结直肠癌裸小鼠肺转移的影响将裸小鼠随机分为注射BTG1过表达的HCT-116单克隆细胞悬液组与尾静脉注射结直肠癌细胞悬液组,接种后50天通过Bouin氏液对标本进行苦味酸染色来确定肿瘤组织,用肉眼观察癌灶测量记录肺转移灶的数目和大小。结果1、第一部分:BTG1过表达对结直肠癌细胞黏附、迁移和侵袭能力的影响(1)通过Western blot和实时PCR检测分析筛选出BTG1转染成功的三组单克隆细胞;(2)相比于HCT-116组,筛选出的BTG1转染成功组的同质性和异质性黏附能力减弱;(3)划痕修复实验显示BTG1过表达细胞的迁移能力减弱;(4)Transwell检测显示BTG1过表达细胞的侵袭的能力减弱;(5)免疫荧光染色观察发现片状伪足形成减少。2、第二部分:BTG1过表达对结直肠癌细胞表型分子表达的调节作用(1)相比于HCT-116组,BTG1转染成功组的表型相关分子的蛋白表达水平:c-jun、JNK和DJ-1蛋白表达下调,但Twist、WAVE2、PI3K和snail的表达无明显差别,而唯有CEA表达上升;(2)利用RT-PCR和ELISA检测CEA表达水平,发现CEA在BTG1过表达的细胞中高于对照组。3、第三部分:BTG1对结直肠癌裸小鼠肺转移的影响相比于Clone40组,接种HCT116细胞的裸小鼠经苦味酸染色后,发现肺表面与淋巴结有肿瘤结节。结论根据实验结果我们认为,BTG1抑制细胞侵袭可能不是通过调节细胞的EMT,而是通过抑制JNK信号通路活化来对肿瘤侵袭、转移产生抑制作用。但其细胞黏附具体机制和CEA表达的调控作用的信号分子还需后续体外及体内实验进一步验证。