【摘 要】
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研究目的:肝移植是治疗肝衰竭的理想方法,但受限于供体短缺及移植排斥。肝组织工程为肝衰竭患者带来新的希望。体外肝细胞三维培养是肝组织工程的核心环节,肝脏本身就是一个极佳的肝细胞培养反应器,肝细胞极性是肝脏生理功能的基础,因此只有完全仿生的三维培养,才能最大程度维持肝细胞极性和功能表型。现有三维培养研究存在不足:仅实现肝细胞在三维环境中培养,不能完全重现肝脏精细的肝板三维拓扑结构及微环境,使其活力功能
【基金项目】
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国家863计划（2012AA020505）； 国家自然科学基金（81470875）； 广东省科技计划重大项目（2014B020227002）； 广东省科技计划项目（2015B090903069）,广东省人工器官与组织工程研究中心建设； 广东省科技计划项目（2015
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研究目的:肝移植是治疗肝衰竭的理想方法,但受限于供体短缺及移植排斥。肝组织工程为肝衰竭患者带来新的希望。体外肝细胞三维培养是肝组织工程的核心环节,肝脏本身就是一个极佳的肝细胞培养反应器,肝细胞极性是肝脏生理功能的基础,因此只有完全仿生的三维培养,才能最大程度维持肝细胞极性和功能表型。现有三维培养研究存在不足:仅实现肝细胞在三维环境中培养,不能完全重现肝脏精细的肝板三维拓扑结构及微环境,使其活力功能虽较二维培养有所提高但仍无法与在体肝细胞相比;缺乏理想的体外三维培养模型,对肝细胞极性相关研究缺乏及相关结论没有代表性。本研究拟通过仿肝板肝组织三维培养,增设完善、标准的实验对照,对仿生状态下肝细胞活力、功能、极性系统比较,并转录组测序分析肝细胞极性相关通路改变并验证,为体外肝细胞三维培养、极性研究提供更好的三维培养平台,为肝组织工程、生物人工肝、药物评价等奠定基础。实验方法:1.制作微流控芯片并进行仿肝板三维培养、混合三维培养;进行三明治培养及混合二维培养;2.组织形态观察,肝细胞活力、功能检测;3.肝细胞极性检测;4.转录组测序分析肝细胞极性相关通路改变并验证。实验结果:1.组织形态维持:仿肝板三维培养＞混合三维培养＞三明治培养＞混合二维培养,细胞增殖及凋亡趋势:混合二维培养＞三明治培养＞混合三维培养＞仿肝板三维培养;2.仿肝板三维培养组肝细胞活力优于其他各组;3.肝细胞功能蛋白水平:随着培养时间延长,仿肝板三维培养组白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、CYP1A2、CYP2D6、谷胱甘肽-S-转移酶、安定代谢、氨代谢、睾酮代谢优于其他各组;4.肝功能基因表达:随着培养时间延长,仿肝板三维培养组CYP2D6、CYP1A2、氨甲酰磷酸合成酶（CPS1）、凝血因子Ⅱ（F2）、凝血因子Ⅴ（F5）、凝血因子Ⅶ（F7）表达优于其他各组;5.肝细胞极性蛋白基因表达:随着培养时间延长,仿肝板三维培养组紧密连接Occludin、二肽基肽酶Ⅳ（DPPⅣ）、钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）、白细胞分化抗原147（CD147）优于其他各组;肝细胞极性蛋白荧光染色:F组Occludin蛋白、ZO-1蛋白、MRP2蛋白、CD147蛋白的表达优于其他各组;超微结构:仿肝板组形成更多成熟胆小管结构,优于其他各组;6.转录组测序分析及qPCR验证:仿肝板三维培养促进胆汁分泌通路相关改变,作用机制可能为通过核受体（法尼酯X受体（FXR）、小异源二聚体伴侣受体（SHP）、类视黄醇X受体（RXRα））调控,调节相应胆汁摄取、外排转运体（多药耐药相关蛋白2（MRP2）、多药耐药蛋白MDR1和MDR3、钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）、可溶性载体OST-α）及水通道蛋白8（AQP8）,实现对胆汁的摄取、分泌。实验结论:仿肝板三维培养可促进肝细胞活力、部分重要肝功能及肝细胞极性的改善和维持,肝细胞功能和极性有一定对应关系,可促进胆汁分泌相关通路改变。本研究为三维培养下仿生肝脏生理结构提供科学依据及有力证据,建立的相关技术体系及培养肝组织可作为一种更优的体外三维培养平台及基本单位,应用于药物研发、肝细胞极性研究、生物人工肝生物反应器设计、肝组织工程组织器官构建、胆汁淤积性肝损伤的研究。
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