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研究目的
骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是最常见的关节疾病，导致关节软骨组织损害，并可累及整个关节组织。该疾病最终表现为关节软骨退变、纤维化、断裂及整个关节面的损害。本病好发于中老年人，是老年人致残的主要原因。软骨细胞的分化在关节软骨的病变中发挥至关重要的作用，对于软骨细胞分化调控机制的研究一直是领域内的热点之一，亟待进一步深入与完善。
促甲状腺激素(Thyroid stimulating hormone，TSH)由垂体前叶分泌，是直接调节甲状腺形态和功能的关键激素，促进甲状腺激素的合成与分泌，维持甲状腺滤泡的生长发育。最新研究发现TSH可不依赖于甲状腺激素，独立作用于甲状腺外的靶器官，参与多种疾病的发生发展，研究表明高水平TSH也参与了甲状腺功能减退症骨骺发育不良的过程，但机制尚不明确。我们前期的研究发现TSH受体在软骨细胞上高表达，TSH可直接作用于软骨细胞，影响软骨细胞的凋亡。但TSH是否影响软骨细胞的分化，其内在机制是什么尚未有报道。本研究首先明确了TSH对软骨细胞分化的作用，其次利用RNA-seq技术发现TSH对软骨细胞分化发挥作用的关键基因CTRP3和通路，进而深入探究了CTRP3在TSH对软骨细胞分化的影响中的作用。
研究方法
实验对象:小鼠原代软骨细胞(Primary mouse chondrocytes，PMCs)
1.原代细胞提取与培养:将出生3-5天的C57乳鼠处死，取出乳鼠的髋关节和膝关节处的软骨组织，留意软骨组织与软骨下骨的界限，全程注意无菌操作。取下的软骨放入无菌磷酸盐缓冲溶液中，将软骨周围肌肉等组织剔除干净，并用无菌磷酸盐缓冲溶液多润洗几遍。配置适量1mg/ml胶原酶消化液消化软骨组织，37℃5％二氧化碳的培养箱中消化18.5h。消化后洗涤3次，期间用100μm与49μm的滤网进行两次过滤。洗涤过滤好的细胞重悬计数，用含有10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素溶液和100μM维生素C的培养基进行培养。细胞融合度为75％左右便可以给予bTSH刺激，时间为48h。
2.采用qRT-PCR、Westernblotting、免疫荧光染色检测TSH刺激组与对照组标本细胞基质Aggrecan、ColⅡ、ColⅩ表达量的变化，以及MMP3和MMP13的变化。采用qRT-PCR和ELISA方法检测TSH刺激组与对照组标本炎症因子指标的变化，如IL-1β、IL-6和TNF-α。
3.采用Westernblotting技术检测TSH刺激组与对照组标本中IκBα、p-p65表达量的变化，以及两组中细胞核蛋白p-p65表达量的变化。
4.提取软骨细胞中的RNA，一定要严格控制每一个样品的质量，接下来进行Illumina转录组测序，将得到的结果进行转录组表达谱分析。使用统计学方法，比较TSH实验组与对照组差异表达基因，并对差异表达基因进行基因本体(Gene Ontology，GO)聚类分析、京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto-Encycl opedia of Genes and Genomes，KEGG)通路和Reactome通路富集分析，分析差异基因的生物学意义。
5.根据转录组学结果并查阅文献，选择CTRP3进行下一步研究。采用qRT-PCR、Westernblotting、免疫荧光染色验证CTRP3在TSH刺激组与对照组标本中的表达。
6.原代软骨细胞转染CTRP3过表达质粒并验证效率，在此基础上给予TSH刺激。分为四个组分别有采用qRT-PCR、Westernblotting与免疫荧光染色检测各组中细胞外基质Aggrecan、ColⅡ、ColⅩ表达量的变化，以及基质金属蛋白酶表达量MMP3、MMP13的变化。采用qRT-PCR和ELISA方法检测各组中炎症因子指标的变化，如IL-1β、IL-6和TNF-α。
7.原代软骨细胞CTRP3过表达后给予TSH刺激。采用Westernblotting技术检测各实验组标本IκBα、p-p65表达量的变化，以及各组中细胞核蛋白p-p65表达量的变化。
研究结果
1.TSH刺激软骨细胞后促进软骨细胞分化。qRT-PCR、Westernblotting、免疫荧光显示，TSH刺激组原代软骨细胞细胞外基质Aggrecan与ColⅡ合成减少，ColX表达增加。
2.TSH促进MMP3和MMP13的表达。qRT-PCR、Westernblotting、免疫荧光染色结果显示，TSH刺激后原代软骨MMP3和MMP13的合成增加。
3.TSH促进软骨细胞中炎症因子分泌。qRT-PCR表明TSH刺激后的原代软骨细胞IL-1β、IL-6和TNFα在mRNA水平表达量增多。ELISA检测细胞培养上清中炎症因子，结果显示TSH刺激后IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高。
4.TSH刺激后中NF-κB通路激活。Westernblotting表明TSH刺激后，原代软骨细胞IκBα蛋白表达减少，p-p65蛋白表达增多;p-p65蛋白入核增加。
5.Illumina转录组测序结果表明，在TSH刺激组与对照组中有716个差异表达基因，其中259个上调差异基因，457个下调差异基因。对716个差异基因进行富集分析。GO富集分析，结果表明差异表达基因主要富集在第二信使信号通路、细胞外基质等功能。KEGG通路分析，结果表明差异基因主要参与细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路等信号通路。Reactome通路分析，结果显示差异基因主要参与GPCR配体结合和胶原生物合成修饰酶等信号通路。
6.TSH抑制软骨细胞CTRP3的表达。qRT-PCR、Westernblotting、免疫荧光染色结果显示，TSH刺激组中CTRP3表达量相比于对照组标本明显减少。
7.CTRP3过表达能有效减少TSH对软骨细胞的损伤。qRT-PCR、Westernblot和免疫荧光显示，CTRP3过表达组原代软骨细胞ColⅡ、Aggrecan表达量增多，ColⅩ表达减少;MMP3、MMP13表达明显减少。qRT-PCR、ELISA显示，CT-RP3过表达组原代软骨细胞IL-6、TNF-α、IL-1β表达明显减少。
8.CTRP3过表达抑制NF-κB信号通路的激活。Westernblotting显示CTRP3过表达组原代软骨细胞p-p65表达减少、IκBα表达水平增多;p-p65入核减少。
结论
1.TSH抑制原代软骨细胞细胞外基质成分中增殖的标志物Aggrecan和ColⅡ的合成，促进了分化指标ColⅩ的合成，进而促进了软骨细胞分化，呈肥大样改变。
2.TSH促进软骨细胞中基质金属蛋白酶MMP3与MMP13的表达，加速细胞外基质的分解。
3.TSH促进软骨细胞中炎症因子IL-1β、IL-6与TNF-α的分泌。
4.TSH刺激后软骨细胞NF-κB通路激活。
5.转录组学结果分析发现，TSH刺激组与对照组有716个差异基因，其中259个上调差异基因，457个下调差异基因。差异基因富集于多条信号通路，如细胞因子-细胞因子受体相互作用和IL-17信号通路、GPCR配体结合和胶原生物合成修饰酶等信号通路。差异基因CTRP3可能是TSH刺激软骨细胞分化中起关键作用的候选基因。
6.验证TSH刺激后软骨细胞CTRP3的下调表达，并且CTRP3过表达后减弱了TSH对原代软骨细胞的损伤，主要表现在Aggrecan和ColⅡ的合成增加，ColⅩ减少;MMP3与MMPI3表达量减少，炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达量减少;NF-κB通路的激活受到抑制。
骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是最常见的关节疾病，导致关节软骨组织损害，并可累及整个关节组织。该疾病最终表现为关节软骨退变、纤维化、断裂及整个关节面的损害。本病好发于中老年人，是老年人致残的主要原因。软骨细胞的分化在关节软骨的病变中发挥至关重要的作用，对于软骨细胞分化调控机制的研究一直是领域内的热点之一，亟待进一步深入与完善。
促甲状腺激素(Thyroid stimulating hormone，TSH)由垂体前叶分泌，是直接调节甲状腺形态和功能的关键激素，促进甲状腺激素的合成与分泌，维持甲状腺滤泡的生长发育。最新研究发现TSH可不依赖于甲状腺激素，独立作用于甲状腺外的靶器官，参与多种疾病的发生发展，研究表明高水平TSH也参与了甲状腺功能减退症骨骺发育不良的过程，但机制尚不明确。我们前期的研究发现TSH受体在软骨细胞上高表达，TSH可直接作用于软骨细胞，影响软骨细胞的凋亡。但TSH是否影响软骨细胞的分化，其内在机制是什么尚未有报道。本研究首先明确了TSH对软骨细胞分化的作用，其次利用RNA-seq技术发现TSH对软骨细胞分化发挥作用的关键基因CTRP3和通路，进而深入探究了CTRP3在TSH对软骨细胞分化的影响中的作用。
研究方法
实验对象:小鼠原代软骨细胞(Primary mouse chondrocytes，PMCs)
1.原代细胞提取与培养:将出生3-5天的C57乳鼠处死，取出乳鼠的髋关节和膝关节处的软骨组织，留意软骨组织与软骨下骨的界限，全程注意无菌操作。取下的软骨放入无菌磷酸盐缓冲溶液中，将软骨周围肌肉等组织剔除干净，并用无菌磷酸盐缓冲溶液多润洗几遍。配置适量1mg/ml胶原酶消化液消化软骨组织，37℃5％二氧化碳的培养箱中消化18.5h。消化后洗涤3次，期间用100μm与49μm的滤网进行两次过滤。洗涤过滤好的细胞重悬计数，用含有10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素溶液和100μM维生素C的培养基进行培养。细胞融合度为75％左右便可以给予bTSH刺激，时间为48h。
2.采用qRT-PCR、Westernblotting、免疫荧光染色检测TSH刺激组与对照组标本细胞基质Aggrecan、ColⅡ、ColⅩ表达量的变化，以及MMP3和MMP13的变化。采用qRT-PCR和ELISA方法检测TSH刺激组与对照组标本炎症因子指标的变化，如IL-1β、IL-6和TNF-α。
3.采用Westernblotting技术检测TSH刺激组与对照组标本中IκBα、p-p65表达量的变化，以及两组中细胞核蛋白p-p65表达量的变化。
4.提取软骨细胞中的RNA，一定要严格控制每一个样品的质量，接下来进行Illumina转录组测序，将得到的结果进行转录组表达谱分析。使用统计学方法，比较TSH实验组与对照组差异表达基因，并对差异表达基因进行基因本体(Gene Ontology，GO)聚类分析、京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto-Encycl opedia of Genes and Genomes，KEGG)通路和Reactome通路富集分析，分析差异基因的生物学意义。
5.根据转录组学结果并查阅文献，选择CTRP3进行下一步研究。采用qRT-PCR、Westernblotting、免疫荧光染色验证CTRP3在TSH刺激组与对照组标本中的表达。
6.原代软骨细胞转染CTRP3过表达质粒并验证效率，在此基础上给予TSH刺激。分为四个组分别有采用qRT-PCR、Westernblotting与免疫荧光染色检测各组中细胞外基质Aggrecan、ColⅡ、ColⅩ表达量的变化，以及基质金属蛋白酶表达量MMP3、MMP13的变化。采用qRT-PCR和ELISA方法检测各组中炎症因子指标的变化，如IL-1β、IL-6和TNF-α。
7.原代软骨细胞CTRP3过表达后给予TSH刺激。采用Westernblotting技术检测各实验组标本IκBα、p-p65表达量的变化，以及各组中细胞核蛋白p-p65表达量的变化。
研究结果
1.TSH刺激软骨细胞后促进软骨细胞分化。qRT-PCR、Westernblotting、免疫荧光显示，TSH刺激组原代软骨细胞细胞外基质Aggrecan与ColⅡ合成减少，ColX表达增加。
2.TSH促进MMP3和MMP13的表达。qRT-PCR、Westernblotting、免疫荧光染色结果显示，TSH刺激后原代软骨MMP3和MMP13的合成增加。
3.TSH促进软骨细胞中炎症因子分泌。qRT-PCR表明TSH刺激后的原代软骨细胞IL-1β、IL-6和TNFα在mRNA水平表达量增多。ELISA检测细胞培养上清中炎症因子，结果显示TSH刺激后IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高。
4.TSH刺激后中NF-κB通路激活。Westernblotting表明TSH刺激后，原代软骨细胞IκBα蛋白表达减少，p-p65蛋白表达增多;p-p65蛋白入核增加。
5.Illumina转录组测序结果表明，在TSH刺激组与对照组中有716个差异表达基因，其中259个上调差异基因，457个下调差异基因。对716个差异基因进行富集分析。GO富集分析，结果表明差异表达基因主要富集在第二信使信号通路、细胞外基质等功能。KEGG通路分析，结果表明差异基因主要参与细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路等信号通路。Reactome通路分析，结果显示差异基因主要参与GPCR配体结合和胶原生物合成修饰酶等信号通路。
6.TSH抑制软骨细胞CTRP3的表达。qRT-PCR、Westernblotting、免疫荧光染色结果显示，TSH刺激组中CTRP3表达量相比于对照组标本明显减少。
7.CTRP3过表达能有效减少TSH对软骨细胞的损伤。qRT-PCR、Westernblot和免疫荧光显示，CTRP3过表达组原代软骨细胞ColⅡ、Aggrecan表达量增多，ColⅩ表达减少;MMP3、MMP13表达明显减少。qRT-PCR、ELISA显示，CT-RP3过表达组原代软骨细胞IL-6、TNF-α、IL-1β表达明显减少。
8.CTRP3过表达抑制NF-κB信号通路的激活。Westernblotting显示CTRP3过表达组原代软骨细胞p-p65表达减少、IκBα表达水平增多;p-p65入核减少。
结论
1.TSH抑制原代软骨细胞细胞外基质成分中增殖的标志物Aggrecan和ColⅡ的合成，促进了分化指标ColⅩ的合成，进而促进了软骨细胞分化，呈肥大样改变。
2.TSH促进软骨细胞中基质金属蛋白酶MMP3与MMP13的表达，加速细胞外基质的分解。
3.TSH促进软骨细胞中炎症因子IL-1β、IL-6与TNF-α的分泌。
4.TSH刺激后软骨细胞NF-κB通路激活。
5.转录组学结果分析发现，TSH刺激组与对照组有716个差异基因，其中259个上调差异基因，457个下调差异基因。差异基因富集于多条信号通路，如细胞因子-细胞因子受体相互作用和IL-17信号通路、GPCR配体结合和胶原生物合成修饰酶等信号通路。差异基因CTRP3可能是TSH刺激软骨细胞分化中起关键作用的候选基因。
6.验证TSH刺激后软骨细胞CTRP3的下调表达，并且CTRP3过表达后减弱了TSH对原代软骨细胞的损伤，主要表现在Aggrecan和ColⅡ的合成增加，ColⅩ减少;MMP3与MMPI3表达量减少，炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达量减少;NF-κB通路的激活受到抑制。