【摘 要】
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他克莫司(FK506)是器官移植首选的抗排异药物,国际市场规模已达23亿美元。但其工业生产菌发酵水平低导致原料药生产成本高,可以利用合成生物学技术系统地进行高产改造;此外,链霉菌中蕴含丰富的处于“沉默”状态的次级代谢产物生物合成基因簇,因此可以激活隐性基因簇并从中挖掘新活性化合物,为新药创制提供候选化合物。本论文以他克莫司的工业生产菌筑波链霉菌L19为研究对象,利用合成生物学技术进行他克莫司合成生
【基金项目】
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国家重点研发计划《放线菌药物合成生物体系的网络重构与系统优化》(项目编号:2019YFA0905400);
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他克莫司(FK506)是器官移植首选的抗排异药物,国际市场规模已达23亿美元。但其工业生产菌发酵水平低导致原料药生产成本高,可以利用合成生物学技术系统地进行高产改造;此外,链霉菌中蕴含丰富的处于“沉默”状态的次级代谢产物生物合成基因簇,因此可以激活隐性基因簇并从中挖掘新活性化合物,为新药创制提供候选化合物。本论文以他克莫司的工业生产菌筑波链霉菌L19为研究对象,利用合成生物学技术进行他克莫司合成生物体系的系统重构和隐性基因簇的激活研究,研究成果如下:本研究首先从竞争性次级代谢途径阻断、调控通路重塑和强化前体供应三个方面,对他克莫司工业生产菌L19进行合成生物体系重构。(1)通过RT-PCR分析,明确了他克莫司合成中的可能竞争性途径。对其中3个主要竞争性途径进行阻断获得突变菌株L19-2,他克莫司摇瓶发酵水平从140.3提升至170.3 mg/L,大幅减少了非目标次级代谢产物。(2)采用双向强启动子元件原位替换了菌株L19-2中tcs6和tcs7之间的双向启动子区域,重塑了他克莫司生物合成的调控通路,结果表明基因簇内所有基因转录水平显著提高提高,获得的突变株L19-9摇瓶发酵水平从170.3 mg/L提升至410.3 mg/L。(3)为强化前体供应,在初始发酵培养基Fm中额外添加终浓度6 g/L的异亮氨酸,菌株L19-9他克莫司摇瓶发酵水平从410.3 mg/L提升至603 mg/L;然后采用优化后的培养基在15 L发酵罐中进行发酵试验,发酵水平达830.3 mg/L,表明其具有很好的工业化应用前景。同时,本项目对筑波链霉菌L19中的隐性基因簇进行了激活研究,获得一个具有较强抗肿瘤活性的新颖蒽环类化合物筑波比星。(1)对链霉菌主要调控因子SARPs(Streptomyces Antibiotic Regulatory Proteins)家族的正调控蛋白进行过表达,结合生物活性筛选,分离鉴定到一个新颖的蒽环类化合物,命名为筑波比星(tsukabarubucin)。(2)细胞试验表明,筑波比星与临床抗癌药物阿霉素(doxorubicin)相比,对胃癌、肠癌、乳腺癌、肺癌细胞均表现出更强的抗肿瘤细胞增殖活性。(3)根据筑波比星的化学结构和L19基因组的生物信息学分析,鉴定了筑波比星生物合成基因簇tsu,并推测了其生物合成机制。综上所述,我们成功重构了他克莫司工业生产菌,同时成功挖掘到较强抗肿瘤活性的新颖蒽环类化合物筑波比星,本论文所采用的高产改造和隐性基因簇激活策略具有普适性,对其他工业链霉菌中开展相关研究具有重要的借鉴意义。
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