[目 的]肝脏在大部分切除术后（partial hepatectomy,PHx）恢复再生的能力是独一无二的,但是小肝综合征仍然无法避免。肝窦内皮细胞（Liver sinusoidal endothelial cells,LSECs）是肝脏与外界接触的“守门者”,不仅可以促进和调节底物在血液和肝实质之间的双向转移,形成血-肝细胞屏障而且在再生过程中通过旁分泌促肝细胞生长因子和形成新的血管促进肝脏再生。因此,LSECs在肝再生过程中扮演非常重要的角色。但是其背后的具体分子机制仍然未知。新近研究表明,肝切除术后的肝再生过程是在缺氧状态进行的,缺氧可促进肝脏再生。那么在肝再生中扮演重要角色的LSECs必定也是在缺氧的肝窦微环境发挥促肝再生作用。然而,肝窦缺血缺氧时,LSECs会出现缺氧损伤,并且肝窦亦会出现缺血再灌注的病理生理过程,故此,LSECs也会遭受缺氧-复氧损伤。而LSECs受到损伤后,其特有的“窗口”结构将会消失,从而转变为去分化状态,最终失去促肝再生作用。那么在肝切除术后,LSECs如何适应低氧环境,减轻其缺氧复氧损伤,从而继续发挥其正常促肝再生功能,这背后的具体分子机制如何,目前尚无定论。我们前期发现,低氧培养的LSECs中的类泛素特异性蛋白酶1（SUMO-specific proteases 1,SENP1）、缺氧诱导因子 1-α（Hypoxia inducible factor 1-α,HIF-1 α）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达均较对照组显著升高。而新近研究报道SENP1可促进HIF-1 α稳定及上调其表达,从而作用于下游的VEGF,最终促进肿瘤增殖及血管形成。那么其在肝再生过程是否存在类似过程?据此我们推测,PHx后,处于缺氧状态的LSECs可能通过调控SENP1/HIF-1 α信号轴,上调VEGF的表达,然后促进肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）及其他靶蛋白的分泌,进而促肝细胞和肝血管再生。本实验以LSEC为靶细胞,SENP1为切入点,70%肝切除小鼠为模型,通过体内、外实验,探究SENP1通过依赖HIF-1 α信号通路调控肝窦内皮细胞促进肝再生的机制研究,为临床上预防肝再生障碍提供理论依据。[方 法]1.首先通过建立小鼠70%肝切除模型,明确SENP1在肝再生过程中表达情况。经过RT-PCR及WB实验确认SENP1在肝再生过程,表达上调。然后通过腺相关病毒AAV-8下调肝组织中SENP1表达,测定其肝再生率,明确SENP1可促肝再生。同时肝组织病理学检测肝组织病理学改变,免疫组化检测肝组织Ki-67、vWF的表达,TUNEL法检测肝组织凋亡情况,观察SENP1对肝组织损伤及肝细胞增殖情况的影响。最后明确SENP1对肝大部分切除术后肝再生过程的影响。2.低氧培养小鼠原代LSECs,明确SENP1在低氧培养的LSECs中的表达情况。经过RT-PCR及WB实验确认SENP1在LSECs低氧培养时,表达上调。然后通过扫描电镜、CCK8及EdU检测观察低氧培养时,LSECs的窗口结构变化及增殖能力的情况。最后通过si-RNA分别沉默SENP1、HIF-1α,RT-PCR及WB检测下游基因VEGF表达,并通过扫描电镜及EdU检测明确LSECs的窗口结构及增殖能力情况。由此可以明确SENP1通过HIF-1α信号对LSECs特征性窗口及增殖能力的影响。3.建立体外小鼠原代LSECs缺氧复氧损伤（hypoxia-reoxygenation,H-R）模型,观察LSECs在H-R后表达情况。经过RT-PCR及WB实验确认SENP1在LSECs进行缺氧-复氧后,表达上调。然后通过扫描电镜、CCK8、流式细胞仪分别观察LSECs的窗口、增殖及凋亡情况。最后通过si-RNA沉默SENP1表达,HIF-1α激动剂激活HIF-1α信号。RT-PCR及WB检测HIF-1α、HO-1、凋亡相关蛋白 cleaved-Caspase 3、Bax、Bcl-2 的表达;ELISA 检测 VEGF、IL-6、TNF-α分表达;然后再通过扫描电镜、CCK8、流式细胞仪分别观察LSECs的窗口、增殖及凋亡情况。由此可以明确SENP1通过HIF-1α信号减轻LSECs的缺氧复氧损伤。4.体外实验:SENP1过表达质粒转染小鼠原代LSECs,RT-PCR及WB检测LSECs中SENP1的表达。扫描电镜、CCK8检测其窗口及增殖活力。WB检测HIF-1α、Cyclin D1的表达,流式细胞仪检测细胞周期变化。然后将过表达SENP1的LSECs与肝细胞共培养,EdU观察各组肝细胞增殖活力;ELISA检测VEGF、HGF表达。体内实验:AAV-8-Senp1-RNAi转染小鼠肝脏,下调SENP1表达,DMOG激活HIF-1α信号,然后免疫荧光观察肝窦血管特异性标志物LYVE-1的表达;WB检测肝切除术后1d、3d、5d、7d肝组织中SENP1、HIF-1α、VEGFR2、Id1、WNT2表达,RT-PCR检测VEGF、HGF的表达。由此可以明确SENP1通过HIF-1α作用于VEGF/VEGFR2/Id1信号轴调控LSECs促进肝脏再生。[结 果]1.成功建立小鼠70%肝切除模型。肝切除术后第1天开始,肝再生开启;同时,在肝切除术后第1、3天,肝组织中SENP1表达显著上调。然而使用AAV8-Senp1-RNAi沉默SENP1后,小鼠术后5天生存率下降,转氨酶明显上升,而肝再生率显著下降;HE染色示肝组织细胞水肿加重,组织结构紊乱,脂滴储存减缓;免疫组化示肝组织中Ki-67及vWF表达下降;TUNEL示肝细胞凋亡增加;这些说明SENP1可能通过减轻肝组织损伤及促进肝细胞增殖、血管增殖等途径促进肝脏再生。2.低氧培养LSECs时,扫描电镜示其窗口维持时间更长,CCK8及Edu检测示其增殖活力增强;RT-PCR及WB检测示SENP1、HIF-1 α、VEGF表达上调。然而,在使用 si-SENP1 或 si-HIF-1 α 后,WB 及 ELISA 检测示 LSECs 中 SENP1、HIF-1 α、VEGF表达水平均下降,且扫描电镜示其窗口维持时间变短,EdU示增殖活力下降。由此说明低氧培养时,LSECs可能通过SENP1/HIF-1α/VEGF信号促进其窗口的维持及增殖能力的提升。3.LSECs在进行缺氧-复氧培养后,RT-PCR及WB检测示SENP1表达上调;同时扫描电镜示其窗口结构损害加重,CCK8示其增殖活力受损,流式细胞仪检测示其凋亡加重。而在使用siRNA沉默SENP1后,LSECs在H-R后增殖活力受损增加,窗口结构损害增加,且凋亡率增加;此时WB检测SENP1、HIF-1 α、HO-1、Bcl-2表达下调,而促凋亡相关蛋白cleaved-Caspase 3、Bax表达上调,ELISA检测细胞上清液中VEGF水平下降,IL-6、TNF-α水平上升。而在使用HIF-1 α信号通路激动剂（Rescue组）后,情况又出现逆转。这些说明SENP1通过HIF-1 α信号通路减轻LSECs在H-R后凋亡率及窗口的损害。4.过表达SENP1的LSECs增殖活力增加,窗口维持更好;WB检测示SENP1、HIF-1 α、Cyclin D1表达上调,流式细胞仪检测示细胞S期比例增加。过表达SENP1的LSECs与肝细胞共培养后,EdU检测示肝细胞增殖能力明显提升,ELISA检测细胞上清液VEGF、HGF水平明显上升,而在使用SENP1抑制剂或HIF-1 α抑制剂后,上述情况又出现反转。体内实验部分,沉默SENP1后,免疫荧光示肝组织中LYVE-1表达下调;同时免疫组化示Ki-67表达下调;WB检测肝切除术后1d、3d、5d、7d肝组织中SENP1、HIF-1 α、Id1、WNT2表达下调,RT-PCR检测VEGF、HGF表达下调。然而在使用HIF-1 α信号激活剂脯氨酸羟化酶抑制剂（DMOG）后,上述情况又出现了的逆转。由此说明SENP1可能通过HIF-1 α调控LSECs内VEGF-VEGFR2-Id1-HGF信号轴促进肝大部分切除术后的肝再生。[结 论]1.SENP1可通过减轻肝组织损伤、促进肝细胞增殖、血管生成等方式促进肝大部分切除术后肝脏再生;2.低氧培养的LSECs可通过SENP1/HIF-1 α/VEGF信号轴维持其窗口并促进其增殖;3.SENP1可通过HIF-1 α信号降低缺氧复氧后LSECs的凋亡率、维护其窗口结构,从而减轻了 LSECs的缺氧-复氧损伤;4.SENP1 可能通过 HIF-1 α 调控 LSECs 内 VEGF-VEGFR2-Id1-HGF 信号轴促进肝大部分切除术后的肝再生。