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目的 本实验利用封闭群SD大鼠到近交系Wistar大鼠的同种异体原位肝脏移植模型，以V型复制缺陷型腺病毒为载体，将CTLA4-Ig基因导入供肝内，以编码β-半乳糖苷酶的腺病毒（Adex/LacZ）为对照，探讨CTLA4-Ig基因对同种异体肝脏移植后的免疫耐受的诱导作用及机理：并通过体外实验研究重组CTLA4-Ig融合蛋白对巨噬细胞功能的影响。 方法 1．建立供体封闭群SD大鼠到受体近交系Wistar大鼠的同种异体原位肝脏移植模型。 2．分组：Ⅰ组（同基因移植组）为Wistar大鼠到Wistar大鼠肝移植；Ⅱ组（排斥对照组）为SD大鼠到Wistar大鼠肝移植；Ⅲ组（CsA处理组）为SD大鼠到Wistar大鼠肝移植后用环孢霉素A（CsA）3.0mg/kg/d肌肉注射，共注射13天；Ⅳ组（CTLA4-Ig基因组）为SD大鼠到Wistar大鼠肝移植前7天供体SD大鼠阴茎背静脉注射含有CTLA4-Ig基因的重组腺病毒液1×109PFU，共一次；V组（LacZ+基因组）为SD大鼠到Wistar大鼠肝移植前7天供体SD大鼠阴茎背静脉注射含有LacZ+基因的腺病毒液1×109PFU，共一次。 3．观察指标：各组大鼠的术后情况、生存时间。在移植后第1、3、5、7、12天时间段各杀死3只，酶链免疫吸附试验（ELISA）检测循环血中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ水平；逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测移植物中细胞因子表达；免疫组织化学（IHC）检测移植物中CTLA4-Ig基因的表达及巨噬细胞和CD8+T细胞等免疫细胞浸润状况；TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）观察移植物细胞凋亡情况；同时各时间段移植物的组织切片行排斥反应的病理学分级。 浙江大学硕十学位论文4．体外实验及观察指标：分离培养健康志愿者外周血的巨噬细胞，用含或不含LPS （10n／ml）的有血清培养基培养 6 ，J’时后，用 CsA 0．spg／ml、不同浓度的 CTLA4－Ig重 组蛋白及两者联合使用，分别处理巨噬细胞，并设相应浓度人Ig为对照，24小时后用 ELISA法检测细胞上清液中TGF－61、VEGF等细胞因子的表达。 结 果1．移植大鼠存活时间：排斥对照组移植大鼠存活时间平均为13．17天，与LacZ”基因组相近 （平均为12．33天）；与这两组相比，CTLA4｛g基因组和CsA处理组移植大鼠存活时间 明显延长 1’ )，差异有显著性意义(P（0．of）。2．CTLA4－Ig基因：静脉注射CTLA4－Ig基因重组腺病毒后7天的SD大鼠肝脏中己有CTLA4－Ig 基因表达，而未经处理的供体SD大鼠肝脏和阴茎背静脉注射含有LacZ基因的重组腺病 毒后7天的SD大鼠肝脏均无CTLA4－Ig基因阳性表达。CTL＾4－Ig组在移植术后60天， 移植物中仍能检测到CTLA4－Ig基因的表达。3．细胞因子变化：在排斥对照组和LacZ”基因组循环血中IL－2、IFN－v的表达水平相对较 高，而CTLA4－Ig基因组和CSA处理组IL－10的表达水平较前两组高。CSA处理组循环血 中细胞因子水平的变化介于排斥对照组与CTLA4｛ 基因组之间。4．免疫细胞浸润状况：排斥对照组和LacZ“基因组移植肝在术后第3天后CD。“T细胞浸润增 加；CTLA4｛g基因组的巨噬细胞浸润情况明显较其他组少；CSA处理组的巨噬细胞浸润 介于上述三组之间。CDS1细胞浸润方面，排斥对照组较CTLA4－Is基因组和CsA处理组 明显，CTLA4《g基因组＊1细胞浸润较CSA处理组轻。5，细胞凋亡：排斥对照组和LacZ“基因组凋亡指数（AI）明显高于CTLA4－Ig基因组和CSA 处理组，差异有显著性意义。CTLA4－IS组与CsA处理组相比较，各时间段差异无显著性。 在各级排斥反应中均可见凋亡细胞存在，发生凋亡的细胞主要是肝细胞，且凋亡指数（AI） 与急性排斥反应的分级成正相关。6．移植物病理排斥分级：在移植术后第3天及以后各时间段yLA4－Ig组和CsA处理组大鼠 的排斥程度明显比排斥对照组和L：。z组轻：第12天时间段CTLA4－比处理组大鼠的排斥 －2－ 浙江大学硕士学位论文 程度较CSA处理组轻。7．体外实验：经LPS刺激后的巨噬细胞在CTLA4－Ig融合蛋白处理组上清液中TGF BI含量 较低，并随着CTLA4｛g用药剂量的增加，TGF－el含量呈现下降趋势，而CSA处理组 TGF－pl含量明显增高，两者同时存在时，上清液中TGF－pl含量与CTLA4｛g蛋白单独 用药时的水平相近。在VEGF方面，CTLA4｛g蛋白组巨噬细胞上清液中VEGF的含量增高， 井丫剂量依赖性，而当CSA同时存在时，VEGF的含量下降。 结 论1．以腺病毒为载体的CTLA4刁g基因经静脉注射可以在大鼠肝脏内长时间稳定表达。2．腺病毒介导的 CTLA4｛ g基因可以诱导移植后受体细胞因子网络发生 Th—Th。转变， 并抑制移植物中免疫活性细胞的浸润和移植物细胞凋亡，从而诱导移植后免疫耐受， 延长受体生存时间，效果优于CSA。3．CTLA4－Ig通过与巨噬细胞表面B7分子结合而抑制巨噬细胞的趋化能