论文部分内容阅读
冠状动脉在维持心脏正常生理功能中发挥着重要作用,而冠状动脉血管平滑肌对调节冠状动脉血流和结构支持有着重要意义。因此,了解冠状动脉平滑肌细胞起源和分化过程的机制具有重要意义。心外膜祖细胞(EpiCs)是从前体心外膜细胞发育而来,是覆盖脊椎动物心脏最外层的上皮细胞。在心脏的发育中发挥重要作用,抑制心外膜生长可导致心肌和冠状动脉发育异常。EpiCs在发育过程中经历上皮细胞向间充质细胞转化(EMT),在心外膜下区域形成心外膜来源的细胞(EPDCs),并可在各种因素影响下分化为冠状动脉平滑肌细胞。有研究证实部分冠状动脉发育始于内皮细胞在心外膜下区域形成原始管道,原始管道通过内皮细胞出芽作用自心外膜下延伸至心内膜,最终连接到主动脉以获得血流,然后内皮细胞促进其周围基质细胞分化为血管平滑肌细胞,并最终形成成熟的冠状动脉。最近的研究提示EpiCs可作为心肌梗死后进行心脏细胞移植的候选细胞,因为它们具有多种特殊的特性,包括在心脏发育过程中作为祖细胞的作用。但迄今为止,很少有研究探讨EpiCs及其衍生物作为细胞移植的候选材料。这在一定程度上是由于对EpiCs体内分化机制的不了解和其特异性的分离培养技术所造成的。本研究旨在使用Transwell共培养法,探讨冠脉发育过程中,血管内皮细胞是否可以影响EpiCs的分化从而调节冠状动脉的发育,为心脏疾病的治疗提供新的思路。第一部分心外膜祖细胞的培养与鉴定目的:通过饲养C57BL/6小鼠成功培养小鼠E12.5d的胚胎EpiCs,为研究EpiCs分化为血管平滑肌细胞的机制提供研究基础。方法:将C57BL/6小鼠以1雄2雌进行合笼,在孕鼠E12.5d时提取胚胎小鼠的EpiCs,通过免疫荧光染色和qRT-PCR检测EpiCs特异标志物Wt1和Tbx18的表达。结果:提取的原代细胞高表达EpiCs特异性标志物Wt1和Tbx18,并结合其细胞生长形态,证实EpiCs被成功提取且纯度较高。结论:通过饲养C57BL/6小鼠成功提取培养出EpiCs。第二部分共培养诱导心外膜祖细胞分化为血管平滑肌细胞目的:通过共培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)与EpiCs,诱导EpiCs分化为血管平滑肌细胞。方法:将提取的EpiCs分为实验组和对照组。实验组通过Transwell共培养系统共培养HUVECs和EpiCs。通过免疫荧光染色和qRT-PCR检测血管平滑肌细胞特异性标志物α-平滑肌肌球蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、肌球蛋白重链11(Myosin heavy chain 11,Myh11)在实验组和对照组之间的差异,胶原凝胶收缩实验检测共培养后EpiCs的收缩能力,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测共培养后碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factors,bFGFs)在条件培养基中的差异。结果:共培养干预后,实验组EpiCs的α-SMA、Myh11表达明显增多,mRNA水平显著增加。在胶原凝胶收缩实验中,实验组EpiCs的收缩能力强于对照组。同时,bFGFs的浓度在实验组条件培养基中高于对照组。结论:HUVECs可影响EpiCs向小鼠血管平滑肌细胞的分化,而bFGFs在此过程中起着重要作用。