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研究目的:缺血性脑卒中(Ischemic Stroke,IS)是一种急性的脑血管疾病,它是因脑部血液循环障碍,缺血、缺氧等原因而导致的局限性脑组织的缺血性坏死,是世界第二大死亡和致残的主要原因。因此,寻找防治缺血性脑卒中的新药尤为迫切。(1)本研究通过合成一系列半胱氨酸类似物、烯丙基半胱氨酸和没食子酸的缀合衍生物,通过建立体外缺血再灌注诱导PC12细胞损伤模型筛选出保护效应最佳浓度的化合物S-(4-氟苄基)-N-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-L-半胱氨酸甲酯(MTC);(2)通过PC12细胞缺血再灌注模型,探讨其保护机理以及分子机制;(3)体内建立大鼠中动脉闭塞(MCAO)模型,进一步验证其对脑卒中的保护效应和抗炎效应的具体作用途径和机制;(4)结合实验室先前工作:FGFR1通过对在疼痛传递中发挥重要作用的T型Ca2+通道调节改善了痛觉感受,以及蛋白酶体抑制剂硼替佐米诱导的疼痛研究,促进我们进一步设计和开发FGFR1拮抗剂、蛋白酶体激动剂以及MTC缀合衍生物,作为新型的抗炎、镇痛和神经保护等多靶点药物。方法:利用药物化学杂交原理设计并合成半胱氨酸类似物、烯丙基半胱氨酸和没食子酸的结合物,离体培养大鼠PC12细胞和昆明乳鼠神经元,模拟神经细胞缺血模型,设有空白对照组、缺血组、缺血后加药组(0.1、0.3、1、3μM),通过CCK-8细胞活性检测法筛选出最佳化合物MTC;缺血再灌注诱导PC12细胞损伤,通过Hoechst 33258法检测MTC处理后细胞核型变化以及FITC/PI法检测细胞凋亡情况;通过LDH、SOD、CAT和GPx试剂盒检测细胞中相应LDH、SOD、CAT和GPx的变化,检测MTC对PC12细胞凋亡和抗氧化物酶的影响;Western blot法分析MTC对缺血再灌注诱导PC12细胞损伤后PI3K、p-AKT、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、bax、bcl-2、p-ERK等蛋白水平的表达以及PI3K/AKT抑制剂LY294002预处理后对PI3K、p-AKT蛋白水平表达的影响;将TREK1质粒转染进入COS7细胞中,加入MTC后观察其对TREK1电流密度的影响;在大鼠体内建立中动脉闭塞模型,将SD大鼠随机分为3组:假手术组(sham)、模型组(vehicle)、MTC治疗组,HE染色法检测MTC对大鼠脑部海马区的影响;通过Griess法检测MTC在Raw 264.7细胞中的抗炎活性。结果:揭示烯丙基半胱氨酸和没食子酸的结合衍生物MTC为效果最佳的化合物,在同类化合物的对比中,七类硫化氢供体化合物均能发挥保护缺血神经细胞的效果,其中MTC在低浓度(1μM)就表现出较好的效果;Hoechst 33258的结果显示MTC后处理细胞核无明显聚缩、破裂现象发生,而Annexin V-FITC/PI进一步证实了MTC的抗凋亡作用;缺血再灌注使PC12细胞的凋亡数量增加,LDH水平显著增高,MTC后处理组LDH显著降低;MTC后处理使缺血再灌注诱导PC12细胞损伤的SOD升高、降低ROS的活性,发挥抗氧化作用,CAT和GPx活性增加清除PC12细胞内的过氧化物;MTC后处理增加PI3K、p-AKT、p-ERK蛋白水平的表达,而PI3K抑制剂LY294002会抑制MTC的作用;MTC后处理降低cleaved caspase-3蛋白水平的表达,抑制了凋亡级联反应的激活使大量PC12细胞免受缺血再灌注的损伤;MTC后处理增加Bcl-2的表达,降低Bax的表达,减少PC12细胞凋亡;同时MTC可以显著降低异源表达的TREK1通道的电流密度;大鼠海马区的HE染色结果可以看出,缺血组与空白对照组相比较,细胞周围间隙增宽,凋亡特征明显,神经元数量减少;加药组与缺血相比较,细胞周围间隙缩短,神经元数量增加;Griess法揭示MTC的抗炎活性远优于SAC(IC50>150μM)和GA(69.25±4.22)。结论:1.我们合成并筛选出最佳化合物:烯丙基半胱氨酸与没食子酸的结合衍生物S-(4-氟苄基)-N-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-L-半胱氨酸甲酯(MTC),与先前H2S供体相比较,我们的结果显示低剂量的MTC对缺血神经元有较好的保护作用;2.MTC具有神经保护作用,其作用机制与抗氧化和激活PI3K/AKT和MEK/ERK通路,抑制线粒体凋亡信号通路,降低内质网应激增加细胞的存活率相关。3.MTC通过调节TREK1双孔钾通道对缺血神经元发挥保护作用。4.同时我们实验室已经揭示MTC具有抗炎的功效,尽管MTC对脑缺血大鼠体内炎症因子的影响以及阵痛功效有待进一步研究,但是以上结果表明MTC兼具缺血神经元保护剂和缺血抗炎效应。