香胶甾酮抗膀胱癌的机制研究

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目的:香胶甾酮是一种植物甾醇,来自Commiphora Wightii树的树胶脂,对多种人类肿瘤细胞均有细胞毒性作用。本研究通过体内外实验,观察香胶甾酮/miR-96-5p/PTEN轴在膀胱癌细胞系T24和EJ中的作用,以探究香胶甾酮是否可作为治疗膀胱癌的候选药物。方法:(1)采用CCK-8实验和EdU实验评估香胶甾酮对膀胱癌细胞增殖能力的影响。(2)采用细胞划痕实验和Transwell小室迁移和基质胶侵袭实验评估香胶甾酮对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响。(3)采用Annexin V-FITC/PI染色法、透射电子显微镜法和Western blotting实验评估香胶甾酮对膀胱癌细胞凋亡和自噬的影响。(4)通过在线网站预测,免疫组织化学染色和q RT-PCR评估PTEN和miR-96-5p在膀胱癌样本中的表达,构建miR-96-5p模拟物,探究其对膀胱癌凋亡和自噬的影响,通过双荧光素酶报告实验,验证miR-96-5p是否可以和PTEN直接结合。(5)通过q RT-PCR实验评估香胶甾酮对miR-96-5p表达的影响,通过Annexin V-FITC/PI染色法和Western blotting实验评估在膀胱癌中香胶甾酮与miR-96-5p之间的作用。(6)选取4周龄雌性BALB/c裸鼠进行体内皮下成瘤实验,剥取由T24形成的移植瘤,其中一部分组织放在4%多聚甲醛中固定用于进行免疫组织化学分析,剩下的一部分组织存放在液氮中冻存用于后续实验。结果:(1)CCK-8实验表明香胶甾酮抑制膀胱癌细胞(T24和EJ)的增殖,且呈剂量依赖性(P<0.01)和时间依赖性(P<0.01),但对正常人永生化尿路上皮细胞(SV-HUC-1)的细胞毒性较低。EdU实验进一步证明膀胱癌细胞经香胶甾酮处理后,其增殖期细胞数显著下降(P<0.01)。(2)香胶甾酮处理后的细胞,与对照组相比,其24h迁移的距离显著缩短(P<0.01),穿过Transwell小室的细胞数量也显著下降(P<0.01)。(3)香胶甾酮处理后的细胞,与对照组相比,其细胞凋亡率增加(P<0.01),形成的自噬溶酶体的数量也增加(P<0.01),相关蛋白也有所改变,如:Caspase7、Bax、ATG7、Beclin1的表达和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值都增加(P<0.01),而Bcl-2、p62的表达下降(P<0.01)。(4)香胶甾酮可以促进抑癌基因PTEN的表达(P<0.01),而miR-96-5p可以直接和PTEN结合抑制其表达(P<0.01),miR-96-5p作为癌基因抑制膀胱癌细胞的凋亡(P<0.01)和自噬(P<0.01)。(5)香胶甾酮可以抑制miR-96-5p的表达(P<0.01),香胶甾酮诱导的膀胱癌细胞的凋亡(P<0.01)和自噬(P<0.01)可以被过表达的miR-96-5p减弱(P<0.01)。(6)香胶甾酮可以抑制裸鼠皮下移植瘤的进展(P<0.01),而这种作用可以被过表达的miR-96-5p所逆转(P<0.01)。结论:(1)香胶甾酮抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。(2)香胶甾酮诱导膀胱癌细胞的凋亡和自噬。(3)香胶甾酮通过调控miR-96-5p/PTEN轴影响膀胱癌的凋亡和自噬。(4)香胶甾酮有望成为抗膀胱癌的候选药物,miR-96-5p有望成为抗膀胱癌的治疗靶点。
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