【摘 要】
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目的:本实验首先研究铁超载通过何种信号通路途径来诱导大鼠骨质疏松。其次进一步研究褪黑素促进铁超载大鼠骨质疏松性骨缺损区的骨修复作用机制研究。方法:体内实验:用剂量100mg/kg/3d的柠檬酸铁铵通过腹腔注射的方式作用于年龄8周、体重200克左右的SD大鼠体内,连续9周。使用小型医用骨钻和直径1.5mm的骨穿针做骨缺损手术。骨缺损处理1周后,用不同浓度的褪黑素（0mg/kg/d、40mg/kg/d
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目的:本实验首先研究铁超载通过何种信号通路途径来诱导大鼠骨质疏松。其次进一步研究褪黑素促进铁超载大鼠骨质疏松性骨缺损区的骨修复作用机制研究。方法:体内实验:用剂量100mg/kg/3d的柠檬酸铁铵通过腹腔注射的方式作用于年龄8周、体重200克左右的SD大鼠体内,连续9周。使用小型医用骨钻和直径1.5mm的骨穿针做骨缺损手术。骨缺损处理1周后,用不同浓度的褪黑素（0mg/kg/d、40mg/kg/d、80mg/kg/d）通过腹腔注射的方式作用于柠檬酸铁铵处理的大鼠组,作用时间4周。通过腹主动脉采血,检测大鼠血清铁、大鼠Ⅰ型胶原C端肽、骨钙素、大鼠Ⅰ型原胶原N端前肽;取股骨做Micro-CT检测、HE染色、Masson染色。体外实验:不同浓度的柠檬酸铁铵（0umol/L、100umol/L、200umol/L、400umol/L、800umol/L、1600umol/L）、褪黑素（0umol/L、10umol/L、50umol/L、100umol/L、400umol/L、800umol/L）和PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002（0umol/L、0.1umol/L、1umol/L、5umol/L、10umol/L、30umol/L）培养MC3T3-E1细胞后,用CCK-8比色法观察不同浓度的柠檬酸铁铵、褪黑素以及LY294002对MC3T3-E1细胞增殖的影响。普鲁士蓝铁染色检测柠檬酸铁铵是在MC3T3-E1细胞内还是在细胞外发挥作用。DCFH-DA荧光探针检测MC3T3-E1细胞内活性氧（ROS）水平。用Annexin V-FITC/PI分析MC3T3-E1细胞的凋亡。用台盼蓝染色分析MC3T3-E1细胞的存活率。采用JC-1染色法和DAPI细胞核染色法观察MC3T3-E1细胞的线粒体膜电位变化。RT-PCR检测信号通路相关基因:PI3K、AKT、GSK-3β、P70s6k;凋亡相关基因:Bax、Bcl-2;成骨相关基因:BMP2、RUNX2、OCN、ALP的表达水平。Western blot检测信号通路相关蛋白:PI3K、AKT、GSK-3β、P70s6k激酶;凋亡相关蛋白:caspase-3、PARP、Bax、Bcl-2家族蛋白;成骨相关蛋白:BMP2、RUNX2、ALP、OCN的表达水平。结果:体内实验:铁超载大鼠血清内血清铁浓度升高,骨形成相关蛋白骨钙素、I型原胶原N端前肽的含量降低,骨吸收相关蛋白Ⅰ型胶原C端肽的含量升高;大鼠股骨骨小梁数量、骨密度、骨小梁厚度以及骨体积分数降低,骨小梁分离度提高。褪黑素对铁超载大鼠血清内铁含量升高作用不显著,提高了铁超载导致的骨钙素、I型原胶原N端前肽低表达的表达水平,降低了铁超载导致的Ⅰ型胶原C端肽高表达的表达水平;褪黑素可促进铁超载大鼠的骨小梁再生;褪黑素具有促进铁超载大鼠骨质疏松性骨缺损区的骨修复作用,且剂量在40mg/kg/d的效果最佳。体外实验:柠檬酸铁铵进入MC3T3-E1细胞内发挥作用、且细胞毒作用呈剂量依赖性。柠檬酸铁铵导致MC3T3-E1细胞内ROS水平升高、线粒体功能障碍。柠檬酸铁铵通过caspase依赖机制诱导MC3T3-E1细胞凋亡,降低MC3T3-E1细胞的存活率。柠檬酸铁铵降低MC3T3-E1细胞的增殖、分化、矿化。柠檬酸铁铵使MC3T3-E1细胞内Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP蛋白和Bax基因、蛋白质表达水平上调;Bcl2、BMP2、RUNX2、ALP、OCN蛋白质和基因表达水平下调;PI3K、AKT、GSK-3β、P70s6k激酶磷酸化水平降低。褪黑素可通过降低MC3T3-E1细胞内ROS水平以逆转上述过程,达到治疗铁超载MC3T3-E1细胞的效果。结论:1、柠檬酸铁铵导致的铁超载可使MC3T3-E1细胞内的ROS水平升高,PI3K、AKT、GSK-3β、P70s6k激酶磷酸化水平降低,从而抑制MC3T3-E1细胞的增殖、分化、矿化。此外,MC3T3-E1细胞内ROS水平升高导致线粒体膜电位水平下降,造成线粒体损伤后激活MC3T3-E1细胞细胞内Caspase家族基因,最终导致MC3T3-E1细胞的凋亡。体内实验也表明铁超载可以促进大鼠骨小梁丢失增加、骨密度降低,进而导致大鼠骨质疏松。2、褪黑素可以降低铁超载MC3T3-E1细胞内ROS的水平,使PI3K、AKT、GSK-3β、P70s6k激酶磷酸化水平升高,促进铁超载MC3T3-E1细胞的增殖、分化、矿化。褪黑素也可以促进铁超载MC3T3-E1细胞内线粒体膜电位水平的升高,促进铁超载损伤的线粒体功能恢复,从而抑制Caspase家族基因的激活,进而抑制铁超载导致的MC3T3-E1细胞凋亡。体内实验也表明褪黑素可以通过促进骨小梁的生长、增加骨密度、促进骨修复的方式促进铁超载大鼠骨缺损的修复。
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