衍生于蓝细菌藻胆蛋白的近红外荧光蛋白的定向进化及在斑马鱼出血检测中的应用

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蓝细菌是一类能够进行光合作用的原核生物。通过藻胆体捕获光能并传递给光系统I和II。组成藻胆体的藻胆蛋白结合线性四吡咯色素,从而具有吸收红光或远红光的能力,并能够发射出强烈的荧光。因此,藻胆蛋白是进化近红外荧光蛋白的理想材料。核膜连接蛋白(Apc E)作为藻胆体的终端能量发射器,起到了连接藻胆体和类囊体膜的作用。由于Apc E的水溶性很差,通过缺失Apc E的loop环得到的缺失突变体Apc E(35)具有较好的水溶性。可由Apc E(35)进化出的能够结合胆绿素(biliverdin,简称BV)的突变体Apc E-14的可溶性依然较低。于是,本研究在Apc E-14的基础上进行定点PCR,发现Apc E-14(F76E)这一突变体具有较好的水溶性。Apc E-14(F76E)的分子量只有12.5 k Da且具有远红光的荧光发射光谱(~667 nm)。因此,将其命名为mini Apc E。接下来,本研究以mini Apc E为模板,通过易错PCR(error-prone PCR)的方式,希望进化出能够用于动物细胞成像的荧光蛋白。最终,本研究得到了与血红素氧化酶(HO1)共表达时,能够在动物细胞中具有微弱荧光的突变体。本实验室已经从来自Chroococcidiopsis thermalis sp.PCC7203的Apc F2亚基进化出了一系列的北斗荧光蛋白(Bei Dou fluorescent proteins,简称BDFPs)。其中BDFP1.2与1.6具有远红光(~670 nm)的荧光光谱,而BDFP1.1具有近红外光(~710 nm)的荧光光谱。本研究以BDFP1.6为模板,通过定点PCR的方式,得到了荧光光谱与BDFP1.1相似,但在动物细胞中的荧光亮度要比BDFP1.1亮6.25倍的突变体,并命名为BDFP1.7。通过模拟并分析BDFP1.7的三维结构,本研究以BDFP1.7为模板,并选择BDFP1.7与BV可能有相互作用的残基进行定点PCR,最终得到了比BDFP1.7亮3.24倍的突变体,并命名为BDFP1.8。且BDFP1.8的亮度是i RFP720的2.38倍。此外,研究结果表明BDFPs的有效亮度(动物细胞内的亮度)与分子亮度(荧光量子产率与摩尔消光系数的乘积)没有相关性。有效亮度主要取决于BDFPs与BV的重组速率以及它们之间的亲和力。通过测定BDFPs、IFP2.0以及i RFP720的稳定性。研究结果表明BDFPs的光稳定性、热稳定性以及酸稳定性要明显强于IFP2.0与i RFP720。此外,BDFP1.6与BDFP1.8能够用于动物细胞的双色成像。本研究还以大肠杆菌为载体,开发了一种可以检测活体动物出血的生物传感器,并使用远红光荧光信号作为输出信号。该生物传感器通过在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中缺失hemf基因,并表达HO1、Chu A以及BDFP1.6蛋白而构建。输出荧光信号的BDFP1.6的荧光峰位置在667 nm处,位于远红光的光谱区域。因此,我们将这种生物传感器命名为FRLBD(Far-Red Light for Bleeding Detector)。通过测定FRLBD与血液或血红素的体外反应。本研究发现FRLBD对血红素或血液的检测具有高效性和特异性。为了验证FRLBD是否能够用于体内出血的检测,本研究以斑马鱼为模式动物,并用高浓度的阿司匹林诱导斑马鱼出血,最后,使用卷积神经网络(CNN)来识别图像中的荧光特征。研究结果表明,FRLBD可以用于斑马鱼肠道出血的检测。并且CNN模型预测斑马鱼出血的准确率达到了91%。此外,本文还比较了肠道出血与正常斑马鱼的肠道微生物组成,并且发现在肠道出血的斑马鱼中,肠道内的有害微生物嗜水气单胞菌的含量大大增加,而有益微生物Deefgea和Chitinibacter的含量减少。
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