前言肺癌是世界上发病率及死亡率较高的恶性肿瘤之一，手术是Ⅰ-Ⅱ期非小细胞肺癌的主要治疗手段，但至少有50％的术后患者会发生局部复发或远处转移，有70％的患者不适合再次手术治疗，放化疗及分子靶向治疗成为其主要的治疗手段，但长期使用毒性大费用高又影响其疗效。人们试图从中药有效成分中寻找一种高效、低毒，能抑制肿瘤细胞增殖诱导其凋亡且对放射具有增敏作用的药物，从而为肺癌的临床治疗提供一种新途径。姜黄素（Curcumin，Cur）是从姜科姜黄属植物姜黄（curcumalonga）根茎中提取的一种酚类色素，大量研究表明，姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学功能，且价格低廉，毒性很低(小鼠LD₅₀为2g／Kg)，目前对其抗肿瘤作用的研究主要集中在肿瘤的化学预防方面。最近美国NCI已将其列为第三代防癌药进行临床研究。国内外对姜黄素抗促癌机制的研究主要集中在以下7个方面：①抗诱变及抗NO作用。②对表皮生长因子受体EGFR、PKC信号转导通路的影响。③下调核转录因子，抑制iNOS、COX-2活性。④调控癌基因和抑癌基因的表达。⑤诱导细胞周期阻滞。⑥抑制脲激酶（uPA）活性和MMP-9的分泌。⑦抑制肿瘤血管生成。有关姜黄素对肺癌抗癌作用的研究国外仅限于通过调控肺癌细胞癌基因和抑癌基因表达促其凋亡及抑制血管生成因子表达来抑制肺癌血管生成等；而国内未见相关报道。本课题从诱导凋亡、抑制肿瘤血管生成、放射增敏三个方面观察姜黄素在体外对肺癌A2细胞的作用并通过检测Bcl-2、Bax、survivin、P53、Fas、VEGF、MMP-9、cyclinB₁、P34^cdc2、phos-P34^cdc2、P21及NF-kB蛋白表达活性改变及Ang-1、Ang-2和TSP的mRNA水平的变化从分子水平探讨其机制。一、姜黄素抑制人肺癌细胞（A2）生长、诱导凋亡的作用及其机制（一）实验方法1、细胞培养用含10％（vol／vol）56℃灭活胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃饱和湿度、5％CO2的培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，实验取对数生长期细胞。2、MTT法药物敏感试验消化细胞接种于96孔培养板，培养24h后，分别加入含不同浓度姜黄素的RPMI1640培养液100μl，使姜黄素的终浓度为5、10、20、40，60、80、100和160μmol／L，培养48h后，每孔加入5mg／mlMTT20μl，用酶标仪检测OD值，检测波长为490nm。采用SPSS统计分析软件，应用直线回归法计算IC₅₀。3、Annexin-FITC标记法定量检测细胞凋亡收集细胞，清洗，离心，加入结合buffer，重悬细胞。取195μl细胞重悬液，加5μl Annexin-FITC，室温孵育10分钟。清洗细胞，离心，弃上清，加入190μl结合buffer，重悬细胞。加入10μl 20μg／ml的Propidium Iodide。用FACScan检测细胞膜外表面磷脂酰丝氨酸结合蛋白的表达及死亡细胞DNA含量。4、细胞凋亡的形态学检测细胞经2.5％戊二醛、1％锇酸双固定，梯度乙醇和丙酮脱水，Epon812树脂包埋超薄切片机（AO型）切片，醋酸钠和柠檬酸铅双重染色，JEM-1200EX和H-600型透射电镜下观察并拍照。5、细胞总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳收集细胞，重悬，离心，去上清，重复一次；加入细胞裂解液500μl重悬细胞，50℃水浴3-5小时震荡，离心，吸取水相于另一离心管中，加入1／10体积3MNaCL和两倍体积乙醇混匀，沉淀DNA，去上清，70％乙醇漂洗1-2次，风扇吹干残存液体，加入50μl含100μg／mlRNAseA的TE缓冲液，65℃30 min；取8μl加上样缓冲液上样，1.8％琼脂糖凝胶电泳，采用1-5V／cm电压降，用凝胶成像系统观察和扫描成像。6、Western blot检测A2细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、P53、survivin、Fas收集细胞，裂解，测蛋白浓度，定蛋白，10％SDS-PAGE电泳，转印，TBS封闭，转到Bcl-2、Bax、P53、Fas及survivin一抗4℃，过夜。二抗孵育。TTBS冲洗两次，每次15分钟，转到HRP-标记的羊抗鼠IgG（1：5000）、羊抗兔IgG（1：5000）、马抗羊IgG（1：5000）的二抗中，孵育2小时。用ECL化学发光检测，X-片感光。（二）结果1、MTT法药物敏感试验姜黄素对A2细胞的抑制作用呈浓度依赖性，计算48小时的IC50值为40μmol／L。2、细胞凋亡的形态学检测透射电镜下观察，对照组A2细胞中细胞核及线粒体、内质网等结构清晰，核占细胞体积的大部分。姜黄素作用于A2细胞后可见细胞核固缩、碎裂、无核膜包被；核染色质边集于胞膜，核孔消失；正在形成的凋亡小体和已形成的凋亡小体等超微结构改变。3、Annexin-FITC标记法定量检测细胞凋亡分别收集姜黄素40μmol／L作用24小时、48小时、72小时及正常对照组的细胞进行Annexin V-FITC标记结合流式细胞仪检测细胞凋亡。发现姜黄素作用24小时、48小时，A2细胞凋亡比例较低，分别为9.45％、16.89％；72小时细胞凋亡比例较高，为21.05％。4、DNA琼脂糖凝胶电泳分别收集姜黄素40μmol／L作用24小时、48小时、72小时及正常对照组的细胞进行DNA琼脂糖电泳。48小时，凋亡细胞的DNA由于DNA降解成规则的大片段出现凋亡特有的“梯状”条带，72小时，细胞大多已经坏死，坏死细胞由于其DNA的不规则降解显现一条连续的膜状条带。而正常活细胞DNA基因组条带由于分子量大，迁移距离短，所以停留在加样孔附近5、Western blotting分别收集姜黄素40μmol／L作用6小时、12小时、24小时、48小时及正常对照组的细胞，提取总蛋白，检测凋亡相关蛋白P53、Bcl-2、Bax、Fas、survivin的表达，发现随时间的延长，Bax、P53、Fas蛋白表达水平逐渐升高。而Bcl-2、survivin蛋白表达水平逐渐降低。总之：姜黄素诱导肺癌细胞株A2细胞凋亡是多靶点，多途径的，其与凋亡相关基因的改变、细胞因子的分泌等密切相关。二、姜黄素对血管生成的作用及其机制的研究（一）实验方法1、细胞培养用含10％（vol／vol）56℃灭活胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃饱和湿度、5％CO2的培养箱中培养，HUVEC、A2细胞呈单层贴壁生长，实验取对数生长期细胞。2、MTT法观察姜黄素对HUVECs增殖的影响细胞接种于96孔培养板，培养24h后，分别加入含不同浓度姜黄素的RPMI1640培养液100μl，使姜黄素的终浓度为5、10、20、40，60、80、100和160μmol／L，每组设三个复孔，培养48h后，每孔加入5mg／ml MTT 20μl，继续培养4h后，吸去上清液，加入150μl DMSO液，震荡培养板10min，用酶标仪检测OD值，检测波长为490nm。细胞增殖抑制率（％）=[1-（实验组的OD值-空白组的OD值）／（阴性对照组的OD值-空白对照组的OD值）×100％3、Annexin-FITC标记法定量检测细胞凋亡消化收集细胞，加入结合buffer，重悬细胞，调整细胞数为5×10⁵／ml。取195μl细胞重悬液，加5μl Annexin-FITC，室温孵育，清洗细胞，离心后弃上清，加入190μl结合buffer，重悬细胞。加入10μl 20μg／ml的Propidium Iodide。用FACScan检测细胞膜外表面磷脂酰丝氨酸结合蛋白的表达及死亡细胞DNA含量。4、逆转录PCR检测血管生成素1和血管生成素2（Ang-1、Ang-2）和血小板反应素（TSP）的mRNA水平细胞总RNA提取，采用紫外光谱扫描仪检测总RNA纯度；逆转录；PCR产物分析：取PCR产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果以Ang-1、Ang-2和TSP分别与β-actin条带的吸光度比值表示Ang-1、Ang-2和TSP的mRNA的相对表达强度。5、Western blot检测VEGF、MMP-9蛋白的表达收集细胞，裂解，测蛋白浓度，定蛋白，10％SDS-PAGE电泳，转印，TBS封闭，转到VEGF、MMP-9一抗4℃，过夜。二抗孵育。TTBS冲洗两次，每次15分钟，转到HRP-标记的羊抗鼠IgG（1：5000）、羊抗兔IgG（1：5000）、马抗羊IgG（1：5000）的二抗中，孵育2小时。用ECL化学发光检测，X-片感光。（二）结果1、姜黄素处理HUVEC细胞后MTT法检测结果姜黄素对HUVEC细胞增殖抑制作用呈量效关系：不同浓度姜黄素对培养的人血管内皮细胞的增殖有显著抑制作用。随着姜黄素浓度的增加，作用时间的延长，其抑制作用增强。2、姜黄素对HUVECs凋亡的影响流式细胞术检测浓度为5，10，20，40，80，160μmol／L姜黄素对HUVECs凋亡的影响，结果显示，作用24h后HUVECs细胞凋亡率分别为4.12％，9.44％，15.91％，17.98％，21.05％，22.21％，明显高于对照组1.64％的凋亡率。3、RT-PCR分别收集姜黄素40μmol／L作用6小时、12小时、24小时、48小时及正常对照组的细胞，提取RNA，检测血管生成素-1（Ang-1）、血管生成素-2（Ang-2）及血小板反应素（TSP）的mRNA的表达，可见随姜黄素作用时间的延长Ang-1、Ang-2 mRNA的表达明显低于对照组；TSP的mRNA的表达高于对照组。4、Western blotting分别收集姜黄素40μmol／L作用6小时、12小时、24小时、48小时及正常对照组的细胞，提取总蛋白，检测VEGF及MMP9蛋白的表达显著低于对照组。总之，姜黄素可能通过多种信号途径抑制血管生成：①降低肿瘤细胞血管生成因子（VEGF，Ang-1，Ang-2）和（或）提高抑制因子（TSP-1）的表达水平来调控血管生成因子的平衡，抑制血管生成的表型转换。②抑制血管内皮细胞的增殖，促进内皮细胞的凋亡。③减少基质金属蛋白酶（MMP-9）的表达从而抑制基底膜及细胞外基质的降解。三、姜黄素对人肺癌（A2）细胞放疗增敏的体外实验研究（一）实验方法1、集落形成试验接种细胞于培养皿中，培养24小时后更换含不同浓度的姜黄素（1、5、10μmol／L）培养液继续培养24小时和48小时后，在室温下用¹³⁷Cs放射源照射，照射剂量分别为0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、100y，照射后用药组更换为不含药物的培养液与单纯照射组一起继续培养9天。9天后细胞用95％乙醇固定，姬母萨染色，≥50个细胞记数为一个存活集落，对每个测量点实验均重复三次。集落实验被换算成存活分数，单纯加药组的存活分数为单纯加药组的集落形成率与空白对照组的集落形成率之比，以单纯加药组的存活分数（SF）为基准，对加药照射组的SF进行校正从而得到药物的放射增敏作用。以多靶单击数学模型拟合细胞存活曲线，计算出单纯照射组（对照组）和加药照射组（药物处理组）的Dq值。放射增敏效应以放射增敏比SER_Dq表示。2、FACScan检测细胞周期消化收集细胞，在PBS中清洗，离心，弃上清，加入70％（vol／vol）的冷乙醇，于-20℃放置，PBS洗两次，细胞中加入含RN aseA（0.1mg／ml）的PBS 1ml，置培养箱中，37℃、30分钟。然后细胞在含有50μg／ml propidium iodie的PBS 1ml中染色。用FACScan进行细胞DNA含量和细胞周期分析，所用软件为CELLQEST。3、细胞凋亡检测细胞接种于6孔培养板中，设空白对照（即单纯放射组），实验组（即药物加放射组）浓度分别为5、10、15μmol／L的姜黄素，培养24h接受2、4、6、8Gy照射后，继续培养24h，取100μl细胞悬液，加入DNA-PREPTMLPR 200μl混匀，30s后加入DNA-PREP-TM染色剂（PI染色）2ml混匀。流式细胞仪检测细胞凋亡情况。利用Coulter公司的SystemⅡTM软件处理结果，每次实验均设阴性和阳性对照。4、蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测周期调控因子及NF-kB蛋白水平的表达收集细胞，裂解，测蛋白浓度，定蛋白，样品加入样品缓冲液，10％SDS-PAGE电泳，转印，TBS封闭，封闭后TTBS洗2次，每次5分钟，转到cyclinB₁、P34^cdc2、phos-P34^cdc2、P21、survivin及NF-kB一抗4℃，过夜。二抗孵育。TTBS冲洗两次，每次15分钟，转到HRP-标记的羊抗鼠IgG（1：5000）、羊抗兔IgG（1：5000）、马抗羊IgG（1：5000）的二抗中，孵育2小时。用ECL化学发光检测，X-片感光。（二）结果1、细胞周期检测血清饥饿法同步在G0期的细胞，弃无血清RPMI1640培养基，加入含10％胎牛血清RPMI1640培养基继续培养。每3小时作一次流式细胞仪检测。在经过2小时恢复期后，约在17小时到达G2期，并在22小时到达G2末期。整个细胞周期大约23个小时左右。2、细胞周期阻滞取血清饥饿法同步在G0期细胞，经2小时恢复期后，分别向实验组的3瓶细胞每瓶中加入姜黄素40μmol／L。再取恢复期后18小时的3瓶细胞，每瓶细胞中加入姜黄素，使终浓度为40μmol／L。每3小时收集一瓶细胞，进行流式细胞仪检测。加入姜黄素后，作用于G1期引起轻度G1期阻滞；作用于G2期，引起G2期阻滞，细胞停留在G2期，不发生G2／M期转换。各时间均可见凋亡标志的亚二倍体峰。3、不同处理因素对A2细胞凋亡的影响单纯放射组和药物加放射组分别处理A2细胞后，药物加放射组及单纯放射组均在G0+G1峰之前出现一个明显的亚二倍体峰（凋亡峰），但以药物加放射组更为明显，各处理因素诱导A2细胞凋亡作用强度的顺序为：姜黄素+照射＞姜黄素或照射＞对照。4、Western blotting取同步化恢复期后18小时的细胞，加入姜黄素使终浓度为10μmol／L。作用3小时，再分别收集恢复期后18小时、21小时的细胞，检测cyclinB₁、P34^cdc2、phos-P34^cdc2、P21、survivin及NF-kB、蛋白印迹，在姜黄素处理3小时后，P34^cdc2、phos-P34^cdc2表达量没有改变，cyclinB₁、survivin及NF-kB蛋白表达量减少，P21蛋白表达量增加。总之，姜黄素能增加肺癌细胞的放射敏感性，其机制可能为使A2细胞发生G2／M期阻滞，及抑制NF-kB蛋白的表达；细胞发生周期阻滞与cyclinB₁、survivin蛋白表达量减少，P21蛋白表达量增加有关。1、姜黄素能诱导A2细胞凋亡，凋亡发生可能与c-myc、bcl-2、survivin蛋白表达下降；而bax、fas、p53、Caspase-3的蛋白表达升高相关。2、姜黄素能抑制肿瘤血管生成其作用通过（1）降低肿瘤细胞血管生成因子（VEGF，Ang-1，Ang-2）和（或）提高抑制因子（TSP-1）的表达水平来调控血管生成因子的平衡，抑制血管生成的表型转换。（2）抑制血管内皮细胞的增殖，促进内皮细胞的凋亡。（3）减少基质金属蛋白酶（MMP-9）的表达从而抑制基底膜及细胞外基质的降解。3、姜黄素能提高A2细胞的放射敏感性，可能通过相对特异地使A2细胞发生G2／M期阻滞及降低NF-kB蛋白表达来实现的。