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研究背景:
视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica,NMO)与多发性硬化(multiplesclerosis,MS)在临床上鉴别困难。临床、组织病理学和免疫遗传学的研究都提示NMO有着自身的特征,不同于MS。近年来,血清中的一种抗体,称视神脊髓炎免疫球蛋白G(NMO-IgG)或水通道蛋白-4(Aquaporins-4,AQP-4)抗体,被认为是区分两者的重要标志物。间接免疫荧光试验(indirectimmunofluorescence assays,IFA)证实该抗体能结合小鼠软脑膜、软膜下、virchow-Robin腔及小脑、中脑、脊髓的灰白质交界微血管的AQP-4。
文献中已报道了多种检测血清中NMO-IgG/AQP4抗体方法,包括了经典法(Original NMO-IgG assay)、放射免疫沉淀分析法(radioimmunoprecipitationassay,RIPA),荧光免疫沉淀分析法(fluorescenceimmunoprecipitation assay,FIPA)、酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、AQP4抗体分析法(AQP4 antibody assay)、Western blot法、免疫组化法、流式细胞等方法。但是关于NMO-IgG/AQP4抗体的检测及该抗体与NMO的关系仍然存在一些悬而未决的问题:(1)目前尚未见何种方法作为“金标准”被推荐应用于NMO-IgG/AQP4抗体的检测;(2)在同批次的血清检测中,不同检测方法的检测结果往往存在不一致性,尤其是经典法检测的NMO-IgG,其靶抗原是否一定是AQP4目前尚存在疑问:(3)血清中的NMO-IgG/AQP-4抗体是区分MS与NMO的重要血清标志物,但是脑脊液中的该类抗体检测是否等同于血清中的检测尚未见深入的分析;(4)中国的脱髓鞘患者有别于西方国家,累及视神经和脊髓的患者比率更高,针对这一类患者我们采取何种防治方式的任务非常艰巨,所以早期诊断与鉴别诊断国人NMO并阐明其发病机制意义重大。目前,国外对NMO-IgG/AQP4抗体与NMO的关系研究比国内深入,但是中国的NMO患者的NMO-IgG/AQP4抗体流行病学情况及其与临床特征的关系很少有进行系统性的研究。
研究目的:
[1]建立检测NMO-IgG/AQP4抗体的间接免疫荧光方法和描述其注意事项。
[2]简化NMO-IgG/AQP4抗体的间接免疫荧光程序,并比较C57小鼠、SD大鼠、猴脑基质和转染AQP4基因的HEK-293细胞基质对NMO-IgG/AQP4抗体的间接免疫荧光检测效果的差别,筛选出NMO-IgG/AQP4抗体较理想的方法。
[3]初步探讨了不同方法检测NMO-IgG/AQP4抗体结果不一致的可能原因。
[4]探讨细胞法检测视神经脊髓炎患者脑脊液AQP4抗体的价值。
[5]初步分析中国的NMO患者的AQP4抗体与临床特征的关系。
研究方法:
[1]免疫组化方法(链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法法和间接免疫荧光法)检测AQP4蛋白在在C57小鼠、SD大鼠、猴各器官组织和转染AQP4基因的人胚肾细胞(HEK-293)的分布。
[2]经典法检测NMO-IgG:选择C57小鼠小脑、中脑、肾脏和胃冰冻切片作为基质。人血清经稀释、豚鼠肝粉预处理后,滴加于封闭液处理的上述切片,4℃过夜后滴加荧光素结合的羊抗人IgG的抗体,封片、荧光显微镜观察。实验通过荧光双标技术确定NMO-IgG结合部位与AQP4表达位置是否一致。
[3]比较经典法和修改法检测的差异:选取182血清样本,经典法和修改法分别检测上述血清的NMO-IgG,McNemar检验和Kappa检验评价两种方法的诊断一致性,卡方检验比较两种方法对NMO-IgG阳性率差异和临床诊断价值。
[4]对比不同基质检测的差异:选择来自于C57小鼠、SD大鼠、猴脑冰冻切片作为检测NMO-IgG抗体的基质,转染AQP4基因的HEK-293细胞作为检测AQP4抗体的基质,猴胃、胰腺、肾冰冻切片和人脐静脉内皮细胞作为检测血管内皮细胞抗体的基质。来源于NMO、MS等脱髓鞘患者或其它对照患者的血清经稀释处理后,滴加于上述基质,4℃孵育后、过夜后滴加荧光素结合的羊抗人IgG的抗体,封片、荧光显微镜观察。McNemar检验和Kappa检验评价不同方法的诊断一致性,卡方检验评价不同方法对NMO诊断的临床价值。
[5]脑脊液中AQP4抗体的检测:纳入130例患者脑脊液和血清,细胞检测两类体液的AQP4抗体,统计分析两种体液中AQP4抗体对NMO的诊断价值。
[6]临床资料分析,采用SPSS13.0统计学软件,对比各种参数,行相关性分析。
研究结论:
[1]C57小鼠,SD大鼠和猴的中枢神经系统(软脑膜、软膜下、微血管、室管膜和小脑蒲肯野细胞)、胃、肺和肾组织均是AQP4主要表达丰富的部位,而转染AQP4基因的人胚肾细胞(HEK-293)的胞膜和胞质表达AQP4蛋白,提示它们能作为间接免疫荧光底物来检测血清中靶向该种抗原的抗体。
[2]以C57小鼠的小脑、肾脏和胃冰冻切片作为基质,通过间接免疫荧光经典法能成功检测出人血清中的NMO-IgG抗体,有助于我们对视神经脊髓炎进行诊断与鉴别诊断。
[3]修改小鼠脑间接免疫荧光法对NMO-IgG的检测灵敏度和NMO总的诊断正确率高于经典法。
[4]通过对C57小鼠、SD大鼠、猴脑基质和转染AQP4基因的HEK-293细胞基质检测了NMO、MS、,ON、LETM及对照组血清中的IgG抗体,从临床诊断指标(灵敏度与特异度)比较,细胞法检测AQP4抗体具有高灵敏度和高特异性,推荐其应用于脱髓鞘患者的血清AQP4抗体检测,有助于NMO和其相关综合征的诊断。
[5]通过多种中枢神经系统以外组织基质的荧光模式比较和人脐静脉细胞证实,结合于脑微血管的NMO-IgG的靶抗原除了AQP4外,亦可能是血管内皮细胞抗体,NMO-IgG对于判断AQP4抗体不具有绝对的特异性。
[6]细胞法检测脑脊液中AQP4抗体的诊断正确率高于血清中的检测,两种体液的联合检测可以进一步提高诊断正确率。
[7]AQP4抗体可能在CNS内首先产生,而血清中的AQP4抗体出现是继发性的改变。
[8]临床确诊的NMO患者几乎均与AQP4抗体相关,AQP4抗体阴性患者可能很少见,而NMO高危综合征患者(LETM,双侧视神炎或OSMS)大部分与AQP4抗体有关
[9]MS患者脑脊液中可检测出AQP4抗体,但一般为不典型MS患者,病灶的分布与AQP4表达的部位相一致。