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Methylobacterium sp.MB200是本实验室在前期实验研究中分离的一株兼性甲基营养菌,具有合成L-丝氨酸的能力。然而,其对甲醇的低耐受性限制了该菌的进一步应用,较高浓度的甲醇及其浓度的突然变化通常对这些细菌有一定的毒性作用,2.5%（v/v）甲醇可以完全抑制MB200的生长。甘氨酸是利用甲基营养菌进行工业生产L-丝氨酸的重要前体物,在L-丝氨酸生产工程中,添加一定量的甘氨酸可在一定程度上增加L-丝氨酸的产量。本文从甲基营养菌生长所需的底物（甲醇）和L-丝氨酸工业生产重要的前体物（甘氨酸）耐受的角度出发,通过相关基因的研究以期为更好地利用高甲醇或甘氨酸获得高L-丝氨酸产量奠定基础。实验利用自杀质粒pK18mob,构建质粒载体pK18mob-mutlps,三亲本接合的手段构建甲基营养菌M.sp.MB200突变修复基因mutL的插入突变株MB200m TB。以1.6%甲醇含量作为甲醇诱导的初始浓度,以0.2%为一个梯度,逐步增加诱导驯化环境中的甲醇浓度,在不断地驯化诱导下,平板筛选到10株可以在7%甲醇环境中生长的菌株。利用能够在甲基营养菌中进行基因表达的通用广宿主载体p CM80携带完整的mutL基因,构建重组表达质粒p CM80-mutL,对获得的耐高浓度甲醇的菌株进行突变修复基因mutL的回补,进行遗传稳定性恢复。共获得4株可稳定遗传的重组菌株,通过对菌株生长情况进行分析,其中3株菌较野生菌有了生长速度及菌体量的提升,不仅可以在7%甲醇条件下快速生长繁殖,且其菌体量较野生菌得到极大提升,甲醇耐受性提升近4倍,高效液相色谱分析显示其L-丝氨酸产量相较于野生菌M.sp.MB200均得到提高,其中MB200m TB1的L-丝氨酸产量最高,为23.4 mg/m L,是野生菌的2.4倍;1株菌株较野生菌株只获得了高甲醇耐受性,生长速度、生长量及L-丝氨酸产量未有较大提升。据报道,将甘氨酸作为前体物进行添加的前体发酵被认为是最具前景的L-丝氨酸生产法。本实验室在前期的工作中通过转座子移码突变构建了一系列的突变菌株,其中的一株突变菌的突变基因编码Mar R家族的转录调控基因tmrf,其L-丝氨酸的产生量为野生菌的1.8倍。该基因可能影响作为前体物的甘氨酸进出细胞的量进而引起L-丝氨酸的产量变化。通过构建转录调控基因trmf的插入突变菌株MB200t TB,同时构建trmf基因的回补株MB200t HB和过表达株MB200trmf,在不同甘氨酸添加量的培养基中进行培养,发现突变株MB200t TB在添加有甘氨酸的培养基中其生长量高于野生菌,而回补株MB200t HB生长量与野生菌持平,过表达菌株MB200trmf的生长量低于野生菌株。当培养基中甘氨酸添加量为5μM/m L时,除MB200t TB外其余菌株均出现菌株凝聚成团沉积在培养基底部地现象,并且停止生长。通过制备静息细胞体系,对发酵液进行高效液相色谱分析,结果显示突变株MB200t TB的L-丝氨酸产量为16.3 mg/m L,为野生菌的1.7倍。综上所述:本研究构建了甲基营养菌M.sp.MB200突变修复基因mutL的缺失突变株MB200m TB,通过甲醇诱导驯化筛选出4株可在甲醇含量为7%的培养基上进行稳定遗传生长的菌株,其中3株突变菌株较野生菌株在生长速度和菌体量方面均有所提高,剩余1株突变菌株较野生菌株只在甲醇耐受性方面有所提高,其余改变不大。同时,构建了M.sp.MB200 Mar R家族转录调节基因trmf的插入突变株MB200t TB、回补株MB200t HB和过表达株MB200trmf,比较各菌株的生长情况,发现随着trmf基因的失活,上述三个菌株在培养基中的生长量及生长速度都具有一定的提升,这表明该基因可能与甲基营养菌M.sp.MB200的甘氨酸反馈调节有一定的联系。