目的:关白附多糖被报道具有多种生物活性,但其分离纯化过程未有系统性的研究报道,其中均一多糖的结构解析更是鲜有报道。而多糖的研究中,化学结构的表征是明确其活性物质基础的前提,对于进一步加深其生物活性及作用机制的研究,以建立更广泛的多糖结构-功能关系尤为重要。因此本课题第一章对关白附多糖进行了系统的分离纯化,并对纯化得到的均一多糖进行活性筛选,发现均一多糖KMPB具有促进巨噬细胞分泌NO的作用,提示其可能具有增强巨噬细胞免疫活性的作用;而均一多糖KMPS可抑制LPS诱导的巨噬细胞的NO分泌量,发挥抗炎作用。由于KMPS的结构已在课题组前期工作中完成,因此本课题第一章节重点对KMPB的结构进行解析。基于第一章节中的活性筛选结果,本论文第二章节对KMPB活化巨噬细胞的药效及作用机制进行进一步的研究;第三章节基于KMPS的抗炎活性及糖尿病的“炎症学说”,从炎症角度对KMPS的降糖药效及作用机制进行探讨,以期为关白附多糖的进一步开发及应用提供理论依据。方法:1.关白附多糖的提取与分离纯化方法:采用95%乙醇脱脂,水提醇沉法提取关白附粗多糖;采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱法,SuperdexTM系列分子筛凝胶色谱法对关白附粗多糖进行分离纯化;通过苯酚硫酸法测定总糖含量,间羟基联苯法检测糖醛酸含量,BCA法检测蛋白含量;采用高效液相凝胶色谱法对多糖的均一度进行评价。2.关白附多糖KMPB结构解析方法:采用HPGPC结合标准葡聚糖标准曲线对KMPB分子量进行检测;采用完全酸水解法结合气相色谱法（GC-MS）对单糖组成进行分析;采用甲基化,乙酰化结合气质联用色谱法（GC-MS）对单糖连接方式进行检测,采用傅里叶变换红外光谱法对其特征峰进行分析;采用~1H NMR、13C NMR、DEPT 135 NMR、H-H COSY、HSQC、HMBC核磁分析,对KMPB结构进行综合解析。3.KMPB对巨噬细胞的激活作用研究方法:以不同浓度KMPB作用于RAW264.7巨噬细胞,采用Griess试剂对细胞上清液中NO含量进行检测;采用ELISA法对细胞炎症因子进行检测,采用中性红法对细胞吞噬能力进行检测;采用多粘菌素B排除样品中内毒素的污染;采用Western Blotting法对巨噬细胞激活相关通路蛋白进行检测;采用抑制剂干扰法对参与巨噬细胞活化的通路进行验证。4.KMPS对IL-1β诱导的胰岛细胞炎症损伤的作用:以IL-1β为造模剂诱导Rin-m5f胰岛细胞产生炎症损伤,采用Griess试剂对细胞上清液中NO含量进行检测;采用ELISA法对细胞上清液中胰岛素含量进行检测;采用CCK-8法对细胞活力进行检测。5.KMPS口服给药改善高脂饲料诱导的肥胖小鼠的糖代谢紊乱的研究方法:以高脂饲料作为造模剂诱导小鼠产生肥胖及糖代谢紊乱,以血糖,口服糖耐量,胰岛素耐量,血清胰岛素水平,血清炎症因子水平,胰岛素靶组织炎症水平,胰岛素抵抗指数作为指标评价200mg kg-1 day-1,400mg kg-1 day-1剂量的KMPS口服给药对小鼠糖代谢的药效作用;采用免疫荧光染色及Western Blotting法对组织蛋白表达进行分析;采用HE染色分析,观察组织形态学变化;采用流式细胞术对脂肪组织中巨噬细胞亚型进行检测。结果:1.关白附多糖的提取与分离纯化:采用水提醇沉法得到关白附粗多糖KMP,得率为14.27%。粗多糖KMP经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱法分离得到水部位多糖KMPW,0.1M Na Cl部位多糖KMP01,0.2M Na Cl部位多糖KMP02,得率分别为2.50%,1.03%,0.96%。KMP01,KMP02经过SuperdexTM系列凝胶色谱法纯化得到均一多糖KMPB、KMPS,得率分别为0.17%、0.13%。2.关白附均一多糖KMPB的结构解析:通过一系列化学方法及GC-MS法,1D NMR,2D NMR法对KMPB的结构进行分析,结果表明,KMPB为一分子量为7.76KDa,并含有半乳糖醛酸的酸性多糖。其主链中α-Gal A-（4→1）-β-Gal-（6→1）-β-Gal-（4→1）-β-Gal-(6→,-α-Gal A-（4→1）-β-Rha-（2→1）-α-Gal A-(4→,-α-Gal A-（4→1）-α-Glc-（4→1）-β-Gal-（4→1）-α-Glc-(4→三个片段相连接,并在1,3,4-Gal A的3位,13,6-Gal的3位,1,4,6-Gal的4位连有支链。支链中木糖片段连接于1,3,6-Gal的3位,阿拉伯糖片段连接于1,3,4-Gal A的3位,葡萄糖及半乳糖醛酸交替连接的片段连接于1,4,6-Gal的4位。3.关白附均一多糖KMPB对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用:以不同浓度KMPB作用于RAW264.7巨噬细胞,对其上清液进行检测,发现KMPB可剂量依赖性地促进巨噬细胞分泌NO及细胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β的含量;中性红实验表明KMPB可增强巨噬细胞的吞噬能力。采用PMB排除了样品被内毒素污染的可能。采用Western Blotting法对巨噬细胞激活相关通路蛋白进行检测,结果显示KMPB对巨噬细胞的激活作用可能是通过激活MAPK通路和NF-κB通路实现的;并采用抑制剂干扰实验进行验证,结果表明,MAPK通路和NF-κB通路确实参与了KMPB对巨噬细胞的激活。4.关白附均一多糖KMPS对IL-1β诱导的胰岛细胞炎症损伤的修复作用:采用IL-1β作用于Rin-m5f胰岛细胞诱导胰岛细胞炎症损伤模型。KMPS对胰岛细胞的作用结果表明,KMPS降低了IL-1β诱导的Rin-m5f胰岛细胞NO的分泌量,提高了细胞在高糖刺激下的胰岛素分泌量,提高了胰岛细胞的活力。将KMPS作用于未经IL-1β处理的胰岛细胞,发现KMPS对胰岛细胞不具有直接的促胰岛素分泌作用,进一步说明KMPS可能是通过改善胰岛细胞的炎症损伤来恢复其胰岛素分泌功能的。5.关白附均一多糖KMPS对高脂饲料诱导的糖代谢紊乱小鼠的降糖作用及机制探讨:结果表明,KMPS口服给药可降低高脂饲料诱导的肥胖小鼠的空腹血糖水平,改善小鼠的口服葡萄糖耐量及胰岛素耐量,缓解小鼠的高胰岛素血症;降低小鼠的血清及胰岛素靶组织中炎症因子水平,改善小鼠的胰岛素抵抗状态。其作用机制可能是通过减少脂肪组织中促炎表型M1型巨噬细胞的比例,降低小鼠机体的炎症水平,抑制肝脏中NF-κB蛋白的磷酸化表达,从而降低胰岛素受体底物IRS的丝氨酸磷酸化水平,使IRS/PI3K/AKT/GSK-3β胰岛素信号通路的传导得到恢复,进而改善肥胖小鼠的糖代谢紊乱。结论:从关白附中分离纯化得到的均一多糖KMPB为一分子量为7.76KDa,并含有半乳糖醛酸的酸性杂多糖。其药理活性表明KMPB可通过激活巨噬细胞中NF-κB及MAPK通路活化巨噬细胞,使巨噬细胞的免疫活性增强。纯化得到的RG-Ⅱ型均一多糖KMPS具有抗炎活性,对IL-1β诱导的胰岛细胞的炎症损伤具有修复作用,并可改善高脂饲料诱导的肥胖小鼠的糖代谢紊乱状态,其作用机制可能是通过改善小鼠机体的炎症反应,降低肝脏中胰岛素受体底物的丝氨酸磷酸化水平,从而使IRS/PI3K/AKT/GSK-3β胰岛素信号通路的传导得到恢复,进而改善肥胖小鼠的糖代谢紊乱。由于多糖的生物活性与其化学结构密切相关,因此推测两个均一多糖活性的不同可能是由其化学结构的差异造成的。