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肝脏是人体中药物代谢的主要场所,在许多药物的代谢过程中容易发生药物性肝损伤（Drug-induced liver injury,DILI）,严重者可致肝衰竭甚至死亡。对乙酰氨基酚（N-acetyl-p-aminophenol,Acetaminophen,APAP）是一种常见的解热镇痛药,其在临床上的过量使用容易导致严重的药物性肝损伤。黄芩苷及其苷元黄芩素是中药黄芩的主要活性成分。本研究中,血清生化指标检测和肝组织病理观察分析结果显示,40 mg/kg与80 mg/kg的黄芩苷或黄芩素预防给药均能改善APAP（300 mg/kg）灌胃给药6 h后所诱导的小鼠急性肝损伤。进一步研究发现显示黄芩苷与黄芩素都能够缓解APAP诱导的氧应激肝损伤。核转录因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）信号通路是体内重要的抗氧化信号通路。本研究发现在体外细胞和体内动物上,黄芩苷或黄芩素在APAP致肝毒性情况下均能诱导Nrf2的核转位激活。黄芩苷和黄芩素还能够提高Nrf2下游谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基/修饰亚基（catalytic/modifier subunit of glutamate-cysteine ligase,GCLC/GCLM）和醌NADH脱氢酶1（NAD（P）H:quinone oxidoreductase-1,NQO1）的基因和蛋白表达,并且GCL和NQO1抑制剂可以明显降低黄芩苷或黄芩素对APAP诱导肝细胞毒性的改善作用。在体外细胞水平运用Nrf2小干扰RNA后可以显著降低黄芩苷或黄芩素对APAP诱导肝细胞毒性的抑制作用。进一步运用Nrf2敲除（Nrf2 knockout,Nrf2 KO）动物,发现在Nrf2 KO动物中,预防或治疗给药的黄芩苷或黄芩素对APAP肝毒性的抑制作用均被显著削弱。这些结果提示Nrf2抗氧化信号通路在黄芩苷和黄芩素抑制APAP诱导急性肝损伤中具有重要的参与作用。本研究实验发现,黄芩苷和黄芩素对肝细胞中Nrf2的抑制蛋白Kelch状ECH相关蛋白1（kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1）蛋白的表达没有明显影响;分子对接（molecular docking）实验的结果则提示黄芩苷与黄芩素可以与Keap1上Nrf2的结合区域发生相互作用。已有研究发现p62/SQSTM1（p62）蛋白可以与Nrf2竞争性地结合Keap1蛋白。本研究的结果发现黄芩苷和黄芩素都可以提高肝细胞内p62蛋白的表达。上述结果提示,黄芩苷和黄芩素可能通过提高p62蛋白表达或直接与Keap1上Nrf2结合区域相互作用,使Nrf2从其抑制蛋白Keap1上解离释放,进而诱导Nrf2的核转位激活。已有研究发现Nrf2的磷酸化将有助于其入核激活。接下去蛋白电泳的实验结果发现,在APAP诱导肝细胞毒性的情况下,黄芩苷和黄芩素都能够诱导细胞内Nrf2的磷酸化,还能诱导细胞外信号调节激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2）和蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）的持续磷酸化激活。通过运用ERK1/2和PKC的抑制剂,发现ERK1/2和PKC在调控黄芩苷和黄芩素诱导的Nrf2磷酸化中发挥了重要作用。黄芩苷和黄芩素不影响肝细胞内重要的蛋白磷酸酶包括蛋白磷酸酶2A亚基A（protein phosphatase 2A subunit A,PP2A-A）和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（mitogen-activated protein kinase phosphatase 1,MKP-1）的基因表达,但是降低了细胞内PP2A-A和MKP-1的蛋白表达。通过进一步运用泛素化蛋白酶体降解抑制剂MG132,发现黄芩苷和黄芩素可以诱导蛋白磷酸酶PP2A-A和MKP-1的蛋白降解来减少细胞内PP2A-A和MKP-1的蛋白表达。肝脏的再生和修复在APAP诱导的肝损伤中有重要的参与。在体内动物上观察了黄芩苷在APAP肝损伤的修复阶段（APAP给药24 h、48 h、72 h后）对肝损伤及肝脏再生修复的影响。血清生化指标检测和肝组织病理观察分析结果显示黄芩苷缓解了肝损伤。肝组织病理切片中分裂细胞计数结果显示,黄芩苷能够增加APAP给药后肝脏中的分裂增殖细胞数。通过免疫组化与蛋白电泳实验发现,黄芩苷能够提高APAP给药小鼠24 h、48 h、72 h后肝脏中增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的蛋白表达。这些结果提示黄芩苷能够促进APAP肝损伤后修复阶段的肝再生。已有研究发现核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3）炎性小体可以参与调控肝再生。通过检测分析NLRP3炎性小体相关蛋白的表达发现,黄芩苷能够诱导半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1（cysteine-dependent aspartate-directed protease 1,caspase-1）的剪切成熟,提高成熟的caspase-1,白细胞介素-18（interleukin-18,IL-18）和白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）的蛋白表达。进一步运用NLRP3炎性小体抑制剂发现MCC950能够显著削弱黄芩苷在APAP中毒24 h后促进肝脏再生的作用,提示炎性小体激活在黄芩苷促进APAP肝损伤后肝脏再生的过程中发挥了重要作用。接下去运用重组人IL-18（recombinant human IL-18,rh IL-18）蛋白,通过体外细胞活力检测以及Edu掺入实验发现,rh IL-18能够促进肝细胞的增殖,并且能够提高细胞内PCNA和Cyclin D1的蛋白表达,提示IL-18能够促进肝细胞的增殖。进一步在体内实验中运用重组小鼠IL-18结合蛋白（recombinant mouse IL-18 binding protein,rm IL-18BP）去抑制IL-18的功能,发现rm IL-18BP明显抑制了黄芩苷在APAP中毒24 h后促进肝脏再生的作用,提示IL-18在黄芩苷促进APAP损伤后肝再生中发挥了重要的参与作用。已有研究发现Nrf2与炎性小体的装配激活相关。蛋白电泳实验结果发现在APAP肝损伤后的修复阶段,黄芩苷能够诱导Nrf2在胞浆的聚集,减少其核转位。进一步通过免疫共沉淀实验发现黄芩苷能够促进Nrf2与NLRP3、细胞凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC）和procaspase-1的结合,提示黄芩苷可能通过使Nrf2聚集在胞浆,促进了NLRP3炎性小体的装配激活。进一步运用Nrf2 KO动物,发现在Nrf2 KO动物中黄芩苷对APAP肝损伤后肝再生的促进作用以及诱导NLRP3炎性小体激活的能力都被显著削弱,提示Nrf2在黄芩苷促进炎性小体激活以及促进APAP肝损伤后肝再生修复过程中都有重要的参与。综上所述,黄芩苷在早期急性肝损伤阶段（6 h）以及损伤后期的修复阶段（24 h、48 h和72 h）均具有明显的改善APAP肝毒性的作用。在APAP诱导急性肝损伤的阶段,黄芩苷及其苷元黄芩素能通过提高p62表达或与Keap1上的Nrf2结合区域相互作用,促使Nrf2从Keap1上解离释放,进一步通过降低脱磷酸酶表达,诱导ERK1/2、PKC的持续磷酸化,介导了Nrf2的磷酸化,促进Nrf2核转位激活,提高下游抗氧化酶的表达,抵御了APAP诱导的氧应激肝损伤。在APAP肝损伤后期的修复阶段,黄芩苷能通过诱导Nrf2在胞浆的聚集,导致NLRP3炎性小体的装配激活,释放IL-18诱导肝细胞的增殖,促进了APAP肝损伤后的肝脏再生修复。通过研究,为临床上清热中药黄芩和黄芩苷相关制剂与解热镇痛药APAP的联合使用提供了科学的实验依据,也为APAP肝毒性的治疗提供了思路和策略。