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背景:对乙酰氨基酚（N-acetyl-p-aminophenol,Acetaminophen,APAP）是临床上应用广泛的非处方解热镇痛药,但其过量或饮酒时服用会导致肝损伤甚至是急性肝衰竭或者死亡。实验室前期研究发现,APAP诱导肝损伤过程中会激活多种早期反应基因,其中包括早期生长反应因子1（early growth response 1,Egr1）。但是,Egr1在APAP诱导肝损伤及其损伤后再生修复中的具体作用仍未知。目前针对APAP导致肝损伤的治疗药物仅有N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）,但NAC只在发生损伤后的短时间内有效,因此寻找合适的治疗药物是APAP肝损伤防治的关键。实验室前期研究发现金银花中主要成分绿原酸（chlorogenic acid,CGA）可以改善APAP诱导的急性肝损伤,而且核转录因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2）在其中有重要的参与作用,但是CGA是否对APAP诱导的肝损伤后再生修复仍有治疗效果尚不清楚。目的:本课题主要研究目的是探讨Egr1在APAP诱导肝损伤及损伤后再生修复过程中的重要作用及其具体机制;并在此基础上进一步阐明CGA通过调控Egr1促进APAP诱导肝损伤后再生修复的药效作用及其机制,为CGA的保肝活性提供进一步的科学依据。方法:1.在人正常肝L-02细胞和体内小鼠上,通过运用Western-blot和实时荧光定量PCR（Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR）实验,观察Egr1在体内外APAP所诱导肝损伤及损伤后再生修复过程中的表达以及核转位激活。2.在APAP给药野生型（Wild-type,WT）小鼠或Egr1敲除（Knock-out,KO）小鼠后不同时间点的动物上,通过检测肝功能指标谷丙转氨酶（alanine transaminase,ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）活力以及对肝脏坏死区域面积的分析,评价Egr1在APAP诱导肝损伤及损伤后再生修复过程中的重要作用。3.通过染色质免疫共沉淀测序（Chromatin immunoprecipitation sequencing,CHIPSeq）以及Western-blot、Real-time PCR等实验揭示Egr1在APAP诱导肝损伤过程中发挥重要作用的机制,以及对肝脏中肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）表达的影响。4.采用Western-blot和Real-time PCR等实验结合运用抑制剂,揭示细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2）的磷酸化激活在APAP诱导肝损伤后再生修复过程中对Egr1核转位激活的影响。5.在L-02细胞上,通过细胞增殖实验分析CGA对APAP致肝细胞毒性后细胞生长增殖的促进作用。在体内C57BL/6小鼠上,通过对ALT/AST、肝脏坏死区域面积、分裂期细胞计数进行分析检测,评价CGA促进APAP导致肝损伤后肝脏再生修复的药效。6.在体内C57BL/6小鼠上,采用Western-blot和Real-time PCR实验检测CGA对肝组织中Egr1和Nrf2的核转位激活以及Egr1下游调控基因表达的影响;并通过进一步运用Egr1 KO和Nrf2 KO小鼠证实Egr1和Nrf2在CGA促进APAP诱导肝损伤后肝脏再生修复中的重要作用。结果:1.Western-blot和Real-time PCR实验结果显示,在体内动物和体外细胞上APAP诱导的肝损伤及损伤后再生修复过程中,Egr1的基因表达和核转位激活都有显著的增加。2.在APAP给药WT和Egr1 KO小鼠的动物实验中,肝功能指标ALT/AST和肝脏坏死区域面积的结果显示,APAP给药后,Egr1 KO小鼠上ALT/AST水平和肝脏坏死区域面积与WT小鼠相比都进一步增加,肝损伤也加剧。3.CHIP-Seq数据分析以及Western-blot、Real-time PCR等结果显示Egr1可能通过影响自噬和细胞周期进程参与调控了APAP诱导肝损伤后肝脏的再生修复。与正常WT小鼠相比较,APAP给药Egr1 KO小鼠后,肝脏中微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）的LC3II/LC3I比例和自噬相关蛋白Beclin-1的表达降低,肝脏中自噬小体的生成减少,血清中APAP半胱氨酸加合物（APAP-cysteine adducts,APAP-CYS）的含量增加。Egr1对细胞周期蛋白D1（Cyclin D1,CCND1）的表达有直接调控作用;与正常WT小鼠相比较,APAP给药Egr1 KO小鼠后,肝脏中Cyclin D1的表达被抑制,肝再生被延迟。Egr1可以直接调控选择性自噬接头蛋白（Sequestosome 1,常称p62）的表达,与正常WT小鼠相比较,APAP给药Egr1 KO小鼠后,肝组织中p62蛋白表达和肝损伤后期的Nrf2核转位激活都显著降低,活性氧（reactive oxygen species,ROS）和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的含量则明显增加。Egr1还可以直接调控谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（Glutamatecysteine ligase catalytic subunit,GCLC）和谷氨酸半胱氨酸连接酶调节亚基（Glutamate-cysteine ligase modifier subunit,GCLM）的表达;与正常WT小鼠相比较,APAP给药Egr1 KO小鼠后,肝组织中GCLC和GCLM的表达以及谷氨酸半胱氨酸连接酶（Glutamate-cysteine ligase,GCL）活力都明显下降,谷胱甘肽（Glutathione,GSH）含量也显著降低。在APAP给药后,Egr1 KO小鼠肝脏中TNF-α水平低于正常WT小鼠,但是Egr1 KO对肝脏中生长因子HGF、EGF、VEGF的表达则没有明显的影响。4.体外L-02细胞上,Western-blot和Real-time PCR的实验结果显示ERK1/2在APAP诱导肝细胞毒性后细胞生长增殖过程中被磷酸化激活,且加入ERK1/2的抑制剂U0126后,Egr1的核转位激活被抑制。在体内动物上,Western-blot结果显示ERK1/2在APAP诱导肝损伤及损伤后再生修复过程中被诱导激活。5.L-02细胞上APAP损伤后细胞生长增殖结果显示,CGA可以促进APAP诱导L-02细胞损伤后的细胞生长增殖。C57BL/6小鼠动物实验的结果显示CGA给药可以降低APAP引起的ALT/AST升高,减少肝脏坏死区域面积,促进肝细胞分裂期细胞数目的增加。6.C57BL/6小鼠上Western-blot和Real-time PCR的结果显示,CGA给药APAP中毒的小鼠,可以促进肝脏中Egr1的表达及核转位激活,可以提高Cyclin D1、p62、GCLC、GCLM的表达,对Nrf2的核转位激活也有促进作用。运用Egr1KO和Nrf2 KO小鼠的动物实验结果显示,与正常WT小鼠相比较,APAP和CGA共同给药Egr1 KO或Nrf2 KO小鼠时,CGA抑制APAP肝损伤过程中ALT/AST的升高,减少肝脏坏死区域面积,增加分裂期细胞数目的作用都消失了。结论:1.Egr1在APAP诱导肝损伤及损伤后肝脏再生修复过程中有重要的参与作用,其具体机制可能是通过以下几个方面来发挥的:Egr1可以通过调控自噬相关蛋白的表达,促进自噬小体的生成,加速清除APAP-CYS加合物,减少肝细胞的坏死;可以通过直接调控p62的表达,释放Nrf2,导致Nrf2转录激活,减轻APAP诱导的氧应激肝损伤;可以通过直接调控GCLC和GCLM的表达,增加GCL酶活力,提高肝组织中GSH含量,缓解APAP肝损伤;还可以通过直接调控Cyclin D1的表达,加速细胞周期进程,促进APAP肝损伤后肝脏的再生。同时研究还发现Egr1在APAP诱导肝损伤及损伤后再生修复过程中的转录活化是由ERK1/2的磷酸化激活所介导的。2.CGA在APAP诱导肝损伤后给药可以通过促进Egr1的转录激活,进而调控Cyclin D1、p62、GCLC、GCLM的表达,促进肝损伤后的肝脏再生修复;Egr1KO后,CGA对APAP诱导肝损伤后再生修复的促进作用则明显消失;Nrf2也在CGA促进APAP诱导肝损伤后再生修复过程中有重要的参与作用。