【摘 要】
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背景手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）是一种严重危害儿童健康的急性传染病,可由二十多种肠道病毒（enteroviruses,EVs）引起,其中多数为A组EVs。近年来,非肠道病毒71型、非柯萨奇病毒A组16型的其他EVs引起的HFMD增加。我们前期从本地引起HFMD的其他EVs中,检测到与柯萨奇病毒A组19型（coxsackievirus A19,CV-A
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背景手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）是一种严重危害儿童健康的急性传染病,可由二十多种肠道病毒（enteroviruses,EVs）引起,其中多数为A组EVs。近年来,非肠道病毒71型、非柯萨奇病毒A组16型的其他EVs引起的HFMD增加。我们前期从本地引起HFMD的其他EVs中,检测到与柯萨奇病毒A组19型（coxsackievirus A19,CV-A19）最相似的片段。CV-A19属于C组EVs,是一种难培养的A组柯萨奇病毒,可从呼吸道和胃肠道疾病标本中分离,且与一些严重神经系统疾病有关,但尚未见CV-A19引起HFMD的报道,国内亦无CV-A19的报道。目的1.对CV-A19毒株全基因组测序,分析基因组特征;2.原核表达重组CV-A19 VP1蛋白,制备鼠抗多克隆抗体;3.CV-A19感染细胞,探究其感染能力。方法1.采用步移法设计引物,逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR）扩增CV-A19基因组的中间序列,c DNA末端快速扩增技术扩增其3′和5′末端,测序分析,拼接得到全基因序列,分析其与参考序列的相似性,构建进化树,并进行基因重组分析。2.构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达重组CV-A19 VP1蛋白。纯化该蛋白,免疫小鼠,制备多克隆抗体,Western blot测定效价。3.CV-A19感染人肺（支气管）上皮细胞BEAS-2B、人横纹肌肉瘤细胞（rhabdomyosarcoma,RD）和新生小鼠骨骼肌细胞,观察细胞病变,免疫过氧化物酶单层细胞试验（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）检测病变细胞中的CV-A19VP1蛋白,RT-PCR检测病变细胞中CV-A19 VP1基因3′端片段。结果1.获得CV-A19 2019103106/XX/CHN/2019毒株的全基因组序列（7409bp）,将序列提交至Gen Bank（登录号:MT175706）。分析该株CV-A19序列表明:其VP1全长核苷酸序列与原型株NIH8663（Gen Bank登录号:AF499641）的相似性为86.4%,与国外现有CV-A19毒株的相似性为76.0%～93.1%;其基因组全长核苷酸序列与国外现有全基因组或全编码区CV-A19毒株的相似性为79.8%～89.5%;CV-A19-BBD/BAN/2009（Gen Bank登录号:KC785531）、EV-C113-BBD-48/BAN/2006（Gen Bank登录号:KC344833）和EV-C116-126/RUS/2010（Gen Bank登录号:JX514942）可能是该株CV-A19的遗传供体。2.成功构建了重组原核表达质粒p ET-28a（+）-CV-A19 VP1,诱导表达的重组CVA19 VP1蛋白具有良好的免疫原性,经纯化后免疫小鼠得到的血清Western blot效价不低于1∶32000。3.CV-A19感染BEAS-2B和RD细胞,盲传三代后与模拟感染细胞无明显差异,而感染新生小鼠骨骼肌细胞则与模拟感染细胞明显不同,出现皱缩聚集,用小鼠抗CV-A19 VP1多克隆抗体进行IPMA检测为阳性,用CV-A19 VP1基因3′端引物进行RT-PCR检测为阳性。结论1.CV-A19 2019103106株全基因组长7409bp,与现有毒株的相似性为79.8%～89.5%,可能为3株病毒的重组体;2.制备小鼠抗重组CV-A19 VP1蛋白多克隆抗体,Western blot效价不低于1:32000;3.CV-A19能够感染新生小鼠骨骼肌细胞。
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