【摘 要】
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目的:雌激素缺乏是绝经后骨质疏松症的主要机制,但是近年来发现活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）增加是骨质疏松症的重要危险因素。葛根素具有抗炎、抗氧化、舒张血管等诸多功能,被证明具有抑制破骨细胞分化,防治绝经后骨质疏松症的作用。PI3K-AKT信号通路主要参与调节细胞的生长、增殖和分化并作用于下游的靶基因减弱ROS对细胞造成的损伤。同时通过调控成骨细胞和破骨细胞的存活、
【基金项目】
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国家自然科学基金（81560362）:葛根素诱导小鼠破骨细胞中 Beclin 抑制 Wnt/β-catenin 信号通路的研究；
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目的:雌激素缺乏是绝经后骨质疏松症的主要机制,但是近年来发现活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）增加是骨质疏松症的重要危险因素。葛根素具有抗炎、抗氧化、舒张血管等诸多功能,被证明具有抑制破骨细胞分化,防治绝经后骨质疏松症的作用。PI3K-AKT信号通路主要参与调节细胞的生长、增殖和分化并作用于下游的靶基因减弱ROS对细胞造成的损伤。同时通过调控成骨细胞和破骨细胞的存活、增殖以及分化而参与骨关节炎、骨质疏松症等疾病。本研究拟从抗氧化角度出发,探讨PI3K-AKT信号通路在葛根素对去卵巢骨质疏松小鼠骨组织形态以及破骨细胞增殖、活性及功能影响中的作用。方法:（1）体内实验:选取10～12周龄,体重约20～25g的C57BL/6雌性小鼠24只,按每组8只,随机分为假手术组（Sham）、去卵巢组（Ovx）、葛根素组（Pue）。术后8周,鉴定为绝经后骨质疏松模型后开始给药干预。葛根素组（Pue）:给药剂量按每只2.5mg/100μl,给予葛根素,其余组给予等量生理盐水作为对照。连续给药12周后,每组随机取6只小鼠采取颈椎脱臼法处死。测定指标如下:取左侧股骨进行显微断层扫描（Micro-CT）并通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）法检测骨组织内第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（Phosphatase and tensin homolog,PTEN）、叉头框蛋白O1（Forkhead box protein O1,Fox O1）、过氧化氢酶（Catalase）基因的相对表达量。取右侧股骨制成石蜡切片通过HE染色观察其形态结构并采用免疫组化（IHC）方法观察骨组织中PTEN、P-AKT、catalase蛋白的表达情况。（2）体外实验:将RAW264.7细胞按如下方式分组:对照组（Control）、诱导组（RANKL）、葛根素组（Pue）。采用CCK-8法以及抗酒石酸酸性磷酸酶染色法测定葛根素干预RAW264.7细胞48h后的生长活力、葛根素干预破骨细胞72h后的增殖活力以及葛根素干预前后破骨细胞着色情况;采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）法和蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）检测葛根素干预破骨细胞前后相关分子的检测包括:抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）、基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloprotein-9,MMP-9）、组织蛋白酶K（Cathepsin k）、活化T细胞核因子1（Nuclear factor-activated T cell 1,NFATc1）、PTEN、catalase、磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）、蛋白激酶B（Protein kinase B,PKB/AKT）、P-AKT（ser473）、Fox O1、P-Fox O1。结果:（1）体内实验:（1）术后8周,与Sham组相比,Ovx组小鼠子宫萎缩变小、输卵管变细。HE染色以及Micro-CT结果显示股骨组织分离度增大、骨小梁断裂严重、骨髓腔增大。给药后,Pue组骨小梁增多、骨髓腔缩小,骨连接增多。（2）PCR和免疫组化结果显示,葛根素干预后PTEN、catalase基因表达上调（P＜0.05）,Fox O1基因表达也上调,但差异无统计学意义。PTEN、catalase蛋白表达上调（P＜0.05）,P-AKT蛋白下调,但变化差异不明显。（2）体外实验:（1）25μmol/L和50μmol/L的葛根素干预RAW264.7细胞48h后对细胞的生长活力没有影响,而100μmol/L的葛根素会抑制RAW264.7细胞的生长活力。50μmol/L的葛根素干预破骨细胞72h后对破骨细胞增殖有抑制作用。（2）q RT-PCR以及WB结果显示:与对照组相比,诱导组的TRAP、MMP-9、Cathepsin K、NFATc1基因表达上调而catalase的基因表达下调。PTEN基因在葛根素干预前后无明显变化。P-AKT（ser473）、NFATc1蛋白表达上调,PI3K、AKT蛋白表达无变化。与诱导组相比,葛根素组的TRAP、MMP-9、Cathepsin K、NFATc1基因表达下调,catalase的基因表达上调,PI3K、AKT蛋白表达无变化,P-AKT（ser473）、P-Fox O1、NFATc1蛋白表达下调而Fox O1、catalase的蛋白表达增加。结论:（1）葛根素可能通过升高PTEN的表达来负性调控PI3K-AKT信号通路,促使catalase升高,进而达到缓解、治疗骨质疏松症的作用。（2）葛根素可能通过调控PI3K-AKT信号通路,促进Foxo1的转录活性增加catalase蛋白的表达并发挥其抗氧化活性从而抑制破骨细胞的增殖和分化。
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