【摘 要】
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目的:1.筛选出适宜的忍冬内源U6启动子,构建忍冬CRISPR/Cpf1基因编辑载体。2.分离、鉴定与忍冬白粉病发生密切相关的MLO基因,确定基因编辑位点。3.构建以忍冬U6启动子驱动LjMLO sgRNA的CRISPR/Cpf1基因编辑载体,通过农杆菌介导的遗传转化获得抗白粉病的忍冬新种质。方法:1.以忍冬基因组DNA为模板,克隆并筛选出具有较高转录活性的忍冬U6启动子。2.基于忍冬全基因组测序
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目的:1.筛选出适宜的忍冬内源U6启动子,构建忍冬CRISPR/Cpf1基因编辑载体。2.分离、鉴定与忍冬白粉病发生密切相关的MLO基因,确定基因编辑位点。3.构建以忍冬U6启动子驱动LjMLO sgRNA的CRISPR/Cpf1基因编辑载体,通过农杆菌介导的遗传转化获得抗白粉病的忍冬新种质。方法:1.以忍冬基因组DNA为模板,克隆并筛选出具有较高转录活性的忍冬U6启动子。2.基于忍冬全基因组测序数据,鉴定出MLO家族基因,并分析其理化性质、进化关系、保守结构域、组织特异性和白粉病菌诱导表达模式。3.利用在线工具(CRISPR RGEN Tools)设计目的基因的sgRNA并进行脱靶预测,利用获得的sgRNA设计、合成crRNA序列,构建基因编辑载体。4.利用农杆菌侵染法转化长势良好的无菌苗,诱导愈伤组织,检测抗性种质。结果:1.从忍冬基因组中克隆到4个U6启动子,并将U6启动子连接至携带β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的pBI121载体,成功构建4个LjU6-pBI121融合表达载体,通过农杆菌瞬时转化法转化烟草叶片,筛选得到一个转录活性较高的忍冬U6启动子,命名为LjU6。2.基于忍冬基因组测序结果,对忍冬MLO相关基因进行了克隆和序列分析,得到25个MLO基因,分别命名为MLO1-MLO25,其中8个基因在叶中高表达,2个基因在茎中高表达,2个基因在花中高表达。接种白粉菌后,有4个基因显著上调表达,其中MLO14增加最多。3.通过酶切连接的方法改造了水稻的基因编辑载体,得到Fncpf1-LjU6 和 Lbcpf1-Lj U6 重组载体。以 MLO2、MLO3、MLO14、MLO15、MLO21为目标基因,建立了同时编辑5个MLO基因的CRISPR/Cpf1重组表达载体。4.通过农杆菌介导的遗传转化,获得了 Fncpf1-LjU6编辑的阳性愈伤组织4份,Lbcpf1-LjU6编辑的阳性愈伤组织6份,测序发现Fncpf1-LjU6编辑的L2 同时编辑了MLO2和MLO14基因,Lbcpf1-LjU6编辑的L3同时编辑了MLO2,MLO3,MLO14基因。结论:1.筛选得到了 1 个高转录活性的忍冬U6启动子。2.构建了2个忍冬专用的多基因编辑载体Fncpf1-LjU6和Lbcpf1-LjU6。3.确定了5个与抗白粉病相关的MLO家族基因MLO2、MLO3、MLO14、MLO15、MLO21。4.转化获得的阳性愈伤组织中检测到有多基因同时被编辑。
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