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目的构建慢病毒Islet-1(Insulin gene enhancer binding protein isl-1，胰岛素基因增强子结合蛋白-1)表达载体，感染获取自小鼠胚胎的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs) C3H10T1/2，诱导C3H10T1/2细胞特异性向心肌细胞方向分化。检测该过程中心肌早期发育相关基因Nkx2.5和Mef2c启动子区域DNA甲基化水平的改变，分析明确高表达Islet-1促MSCs向心肌方向分化过程中表观遗传学DNA甲基化调控机制的作用。材料与方法1.构建Islet-1慢病毒表达载体：使用两步PCR法(PCR-basedtwo-step DNA synthesis, PTDS)合成目的基因Islet-1序列片段，将目的基因片段与慢病毒载体pLenOR-THM分别进行双酶切。分别纯化酶切产物，通过连接反应将目的基因与pLenOR-THM载体连接。使用氯化钙法制备细菌感受态细胞，将连接产物转化感受态细胞。挑取克隆菌落，小量抽提质粒进行双酶切反应，将酶切产物纯化后进行PCR反应鉴定阳性克隆。阳性克隆菌液进行测序并与目的基因序列比对分析，比对正确后进行大量质粒抽提，获得Islet-1-pLenOR-THM重组质粒。将构建好的Islet-1-pLenOR-THM重组质粒及辅助包装原件载体质粒pMD2G、pRsv-REV、pMD1g-pRRE分别进行高纯度无内毒素抽提，四种质粒共同转染293T细胞包装生产Islet-1慢病毒表达载体，收集上清液，浓缩后得到高滴度的目的慢病毒液。使用稀释计数法检测慢病毒载体滴度。2.慢病毒载体感染C3H10T1/2细胞：按照细胞数目为4×104/孔将C3H10T1/2细胞铺于24孔板内，待细胞生长至密度达60%时，分别向各孔中加入聚凝胺polybrene并使其最终浓度为8mg/L，按照病毒感染复数MOI=20向各孔内加入相应数量的慢病毒载体，培养24小时后更换为DMEM/F12完全培养基，72小时后观察绿色荧光蛋白表达情况。细胞免疫荧光法检测感染后各实验组细胞Islet-1表达情况。3.细胞分组：本实验包含三个实验组，C3H10组(未经处理的C3H10T1/2细胞，作为空白对照)、阴性对照组(感染慢病毒空载体的C3H10T1/2细胞)和实验组(感染Islet-1慢病毒表达载体的C3H10T1/2细胞)。4.心肌早期发育相关基因启动子区域甲基化水平检测：感染慢病毒载体后2周，分别提取各实验组细胞的基因组DNA并检测浓度，根据浓度计算重亚硫酸盐处理过程中C3H10组、阴性对照组和实验组基因组DNA的上样体积，确保各组DNA的上样量均为350ng。向各实验组细胞的基因组DNA中加入重亚硫酸盐试剂，以与重亚硫酸盐试剂反应后的DNA为模板进行甲基化特异性PCR反应，使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并采集图片。结果1. Islet-1慢病毒表达载体构建：双酶切后PCR鉴定的阳性克隆，测序并与目的Islet-1序列比对结果显示Islet-1-pLenOR-THM重组质粒构建成功。稀释计数法检测慢病毒载体滴度为2×108TU/mL。2.慢病毒载体感染后5天，可观察到阴性对照组和实验组细胞有明显的绿色荧光蛋白表达；阴性对照组感染效率为90.09%，实验组感染效率为87.71%；慢病毒载体感染后4周，C3H10组和阴性对照组细胞形态未见明显改变，实验组多个区域可见细胞排列相对紧密、趋向于同一方向，形态大致呈梭型；荧光显微镜下可见实验组细胞Islet-1蛋白表达明显，且多表达于细胞核内。3.慢病毒载体感染2周后，实验组Nkx2.5和Mef2c基因启动子区域甲基化水平较C3H10组和阴性对照组降低。结论在高表达Islet-1基因促进C3H10T1/2细胞向心肌细胞方向特异性分化的过程中，心肌早期发育相关基因启动子区域DNA甲基化水平降低，促进其表达增加。